cellijnen
De HEK 293T cellijn werd verkregen uit de American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Muis hybridoma cellijnen KT13 en KT22 werden verkregen uit de Ontwikkelingsstudies Hybridoma Bank (DSHB). Beide cellijnen werden in de DSHB gedeponeerd door Kazumasa Takeda en Asako Sugimoto (dshb hybridoma producten KT13 en KT22)., Muis hybridoma cellijn 5E4 / 1F1 werd vriendelijk verstrekt door Miha Kosmač en Vladka Čurin Šerbec (Universiteit van Ljubljana). HEK 293T en hybridoma cellen werden gekweekt in DMEM (Gibco) aangevuld met 13% FBS (Gibco), 1× penicilline/streptomycine (Thermo Fisher) en 1× GlutaMAX (Gibco). HC-en LC-sequenties van antilichamen van individuele hybridomen werden bepaald door reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) en capillaire sequencing (Eurofins Genomics).,
Cycloheximidebehandeling en microsoombereiding
alle pipetteerstappen werden uitgevoerd op ijs en centrifugaties werden uitgevoerd bij 4 °C met behulp van een Eppendorf 5810R centrifuge met vaste hoekrotor F-45-30-11. Eiwit LoBind 1,5 mL centrifugebuizen (Eppendorf) werden gebruikt om celhechting aan de buiswanden te minimaliseren. HEK 293T cellen (1 miljoen), muis hybridoma cellen (1 miljoen van 5E4, KT13, en KT22 cellen gemengd in verhouding 1:1: 1), ARH-77 leukemie cellen (ATCC CRL-1621, 1 miljoen), of vers geïsoleerde menselijke CD19+ B cellen uit pre – en post TD-booster immunisatie monsters (1.,5 miljoen elk) werden geresuspendeerd in 1 mL PBS met 50 µg/mL cycloheximide en gedurende 10 minuten geïncubeerd om ribosomen met geassocieerde boodschapper RNAs (mRNA) op het ruwe endoplasmatische reticulum te stallen. De cellen werden gepelleteerd met 300 g gedurende 10 minuten bij 4 °C en geresuspendeerd door 15× op en neer te pipetteren in 120 µL lysisbuffer met hoge dichtheid (25 mM hepes-KOH pH 7,2, 110 mM kaliumacetaat, 5 mM magnesiumacetaat, 1 mM EGTA, 25% sucrose , 5% glycerol, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× cOmplete EDTA-vrije proteaseremmercocktail , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0,015% digitonine en 400 U/mL RiboLock RNase-remmer )., Cel en organel lysis werd voltooid door incubatie gedurende 10 minuten op ijs. Elk homogenaat werd gesplitst in twee aliquots van 55 µL en overgebracht in twee verse eiwitbuisjes. De buizen werden gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 3 minuten bij 4 °C tot pelletkernen en celresten. Een totaal van 40 µL supernatant uit elke buis, met membraanfracties en cytosol, werd overgebracht in verse eiwit LoBind buizen en de sucrose concentratie werd verdund tot 0,37-0,40 M (12-13% M/M) door toevoeging van 40 µL nucleasevrij water. Microsomen werden vervolgens gesedimenteerd door centrifugeren met 20.800 g gedurende 120 min bij 4 °C., De cytosol-bevattende supernatanten werden weggegooid en membraankorrels werden geresuspendeerd door pipetteren 10× omhoog en omlaag in 85 µL wasbuffer (25 mM hepes-KOH pH 7,2, 110 mM kaliumacetaat, 2,5 mM magnesiumacetaat, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× cOmplete EDTA-vrije proteaseremmercocktail, 0,1 mg/mL cycloheximide, 0,004% digitonine en 400 U/ml RiboLock Rnaseremmer). De microsomen werden opnieuw gesedimenteerd door centrifugering met 20.800 g gedurende 60 min bij 4 °C., Supernatants werden weggegooid en de microsoomkorrels werden geresuspendeerd in 20 µL wasbuffer en op ijs bewaard tot verder gebruik.
Transmissieelektronenmicroscopie
monsteraliquots van 3,5 µL geresuspendeerde HEK 293T-microsomen werden aangebracht op vers ontstoken Quantifoil-roosters (Quantifoil, Duitsland) bedekt met een extra 2 nm koolstofdragende film en ingevroren in vloeibaar ethaan met behulp van een Vitrobot-plunjer (FEI). De monsters werden afgebeeld op een Tecnai Spirit transmission electron microscope (FEI), werkend op 120 kV, uitgerust met een 2 × 2 K Eagle CCD camera (FEI)., Micrografen werden geregistreerd onder cryo-omstandigheden met een lage dosis bij 42.000 × nominale vergroting (pixelgrootte op objectschaal: 5,2 Å/px) waarbij een defocus van − 2 tot − 4 µm werd toegepast. Het verzamelen van gegevens werd handmatig of volledig automatisch uitgevoerd met behulp van Leginon .
emulsie RT-PCR assemblage met behulp van muis hybridomamicrosomen
we verdund 16 µL van geresuspendeerde microsomen uit gemengde hybridomen 5E4, KT13 en KT22 in 184 µL RT-PCR MasterMix met 1× Verso 1-stap RT-PCR MasterMix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg / µL BSA, 100 µg / mL cycloheximide en primers voor reverse transcriptie en HC-en LC-assemblage (0,8 µM elk van de primers TitA_MID1_IgM_rev en TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM elk van de primers OE_MHV_fwd en OE_MKV_fwd). De resulterende 200 µL waterige oplossing werden gebruikt om een water-in-olie emulsie te vormen door druppelgewijze toevoeging (13 aliquots van 15 µL in 30-s intervallen) aan 800 µL olie fase volgens Ge et al. (Minerale olie, Sigma M5904, met 4,5% spanwijdte 80, Sigma S6760, 0,4% Tween 80, Sigma P8074, en 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) tijdens continu roeren op een magnetische roerder., Zes monsters van 100 µL van elk van de resulterende emulsie werd overgebracht naar PCR-buizen en onderworpen aan thermocycling met de volgende voorwaarden: reverse transcriptie bij 50 °C gedurende 15 min, RTase inactivatie bij 95 °C gedurende 2 min, dan vier cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 20 s, gloeien rampdown van 60 °C tot 50 °C voor 50 s en uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, toen 16 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 20 s, het gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging stap bij 72 °C gedurende 5 min., Tegelijkertijd werd een open RT-PCR-controle uitgevoerd door 4 µL geresuspendeerde microsomen te verdunnen in een RT-PCR-MasterMix van 46 µL en de reactie parallel met de emulsie RT-PCR te thermocyclen. PCR-assemblageproducten werden uit de emulsie geëxtraheerd met isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) en de Zymo DNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research) zoals eerder gepubliceerd . Het resulterende DNA en het PCR product van de open PCR controle werden geladen op een 1,2% TBE-agarose gel en gescheiden met 90 V gedurende 60 min., Assemblageproducten met een grootte van 800-950 bp werden uit de agarose-gel geselecteerd en de producten werden teruggewonnen met behulp van een ZYMOCLEAN Gel DNA Recovery kit. Assemblageproducten werden geëlueerd in 6 mM Tris-Cl pH 8 en bewaard bij − 20 °C tot verdere analyse.,
Geneste PCR-amplificatie van muis hybridoma assemblage van de producten
Na de emulsie montage reactie, de assemblage van de producten werden verder versterkt met adapter primers TitA_fwd, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA G 3′, en TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, met behulp van de Phusion high-fidelity-DNA-polymerase kit (Finnzymes) met de volgende thermocycling voorwaarden: Initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, dan 15 cycli van denaturatie bij 98 °C gedurende 7 s en gloeien/uitbreiding bij 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door een laatste verlenging stap bij 72 °C gedurende 5 min., PCR-producten werden gezuiverd met de Zymo DNA Clean & Concentrator-5 kit. Het koppelen van HC en LC in de assemblageproducten werden vervolgens geanalyseerd door PCR met geneste primers specifiek voor de drie verschillende HC en drie verschillende LC (extra dossier 1: Figuur S1e) met behulp van de Phusion high-fidelity DNA polymerase kit met de volgende thermocycling voorwaarden: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, dan 24 cycli van denaturatie bij 98 °C gedurende 7 s en gloeien/uitbreiding bij 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door een laatste uitbreiding stap bij 72 °C gedurende 5 min., Geneste PCR producten werden geladen op een 1,2% TBE-agarose gel en gescheiden met 90 V gedurende 40 min. Realtime geneste PCR voor de kwantificering van kruisbesmetting werd uitgevoerd in triplicaten met dezelfde geneste primers met behulp van SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) op een StepOne qPCR-cycler (Applied Biosystems) met de volgende thermocyclingomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 45 s., De aanvankelijke abundanties van de versterkte assemblageprodukten werden berekend met behulp van de 2^(-deltaCt) methode en uitgezet als staafdiagrammen met foutbalken die standaardafwijking van het gemiddelde aangeven.
immunisatie en CD19 + B-celisolatie uit perifere volbloedmonsters
de humane perifere volbloedmonsters die in dit onderzoek werden gebruikt, werden verkregen van in.vent Diagnostica GmbH als bijproducten van routine diagnostische procedures. in.,vent Diagnostica GmbH heeft schriftelijke geà nformeerde toestemming van de donor om de bijproducten te gebruiken voor onderzoek en heeft een ethische goedkeuring van de Freiburg Ethics Commission International (FEKI code 011/1763) voor de distributie van monsters. Een gezonde proband onderging boostervaccinatie met tetanustoxoïd (TT)/Diptheria toxoïd (DT) (TD-pur®; 20 internationale eenheden TT en 2 IU DT; Novartis, Bazel, Zwitserland)., K2-EDTA perifeer volbloed afkomstig van pre-immunisatie (dag 0) en zeven dagen post-TD booster immunisatie werden gebruikt om CD19+ B-cellen te isoleren met behulp van de CD19 pluribad Cell Separation Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Duitsland) volgens het Protocol van de fabrikant. Geïsoleerde CD19 + B-celkorrels werden gewassen in 1 mL koude PBS en gecentrifugeerd bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Celkorrels overeenkomend met 1,5 miljoen B – cellen van zowel pre-als post-immunisatiemonsters werden op ijs gehouden tot cycloheximidebehandeling en microsoombereiding.,
emulsie RT-PCR assemblage met menselijke B-celmicrosomen
we hebben 2 µL verdunde microsomen, bereid uit bevroren ARH-77 – cellen (als interne koppelingscontrole), toegevoegd aan 26 µL geresuspendeerde microsomen uit B-cellen, zowel pre-als post-TD-immunisatie, zodat de uiteindelijke fractie van ARH-77-microsomen 0,5% (v / v) bedraagt. We verdund 16 µL van deze microsomen suspensie in 184 µL RT-PCR master mix bevat 1× Dart 1-stap RT-PCR master buffer mix (Roboklon), 2× dART master enzym mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide en primers voor reverse transcriptie (IgM, IgG en IgK) en zware (VH) en lichte keten (VK) assemblage. Primer sequenties en concentraties in de RT-PCR master mix zijn vermeld in aanvullend dossier 1: tabel S2., De resulterende 200 µL waterige oplossing werd gebruikt om een water-in-olie emulsie te vormen door druppelgewijze toevoeging (13 aliquots van 15 µL in intervallen van 30 s) aan 800 µL oliefase bestaande uit 73% emulsiecomponent 1, 7% emulsiecomponent 2 en 20% emulsiecomponent 3 van de Micellula DNA emulsion and purification kit (Roboklon) tijdens continu roeren op een magnetische roerder., Zes monsters van 100 µL van elk van de resulterende emulsie werd overgebracht naar PCR-buizen en onderworpen aan thermocycling met de volgende voorwaarden: Reverse transcriptie bij 55 °C voor 30 min, initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, daarna drie cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 20 s, gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en uitbreiding bij 72 °C gedurende 2 min, dan 20 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 20 s, het gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en uitbreiding bij 72 °C gedurende 4 min, gevolgd door een laatste verlenging stap bij 72 °C gedurende 5 min., PCR-assemblageproducten werden uit de emulsie geëxtraheerd met isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) en de Zymo DNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research) zoals eerder gepubliceerd . De resulterende DNAs werden op een 1% TBE-agarose gel geladen en gedurende 45 minuten met 100 V gescheiden. Assemblageproducten van 700-800 bp werden uit de agarose-gel geselecteerd, teruggewonnen met behulp van een ZYMOCLEAN Gel DNA Recovery kit, geëlueerd in 6 mM Tris-Cl pH 8, en bewaard bij − 20 °C tot verdere analyse.,
geneste PCR-versterking van menselijke B-celassemblageproducten
voor specifieke verdere versterking van de HC-LC-assemblageproducten werd een geneste PCR-versterking uitgevoerd met geneste primers specifiek voor IgM -, IgG-en IGK-constante gebieden (aanvullend dossier 1: tabel S2). De PCR-reactie bevatte geneste primers bij 0,4 µM concentraties, 200 µM dNTP mix, 1 × Q5 reactiebuffer en 0,02 u/µL Q5 high-fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) in een reactievolume van 50 µL met 3 µL geassembleerd DNA., Geneste PCR-amplificatie werd uitgevoerd onder de volgende thermocyclingomstandigheden: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 3 min, vervolgens 34 denaturatiecycli bij 98 °C gedurende 30 s en gloeien/verlengen bij 71 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlengstap bij 72 °C gedurende 5 min. Monsters werden verzameld na drie verschillende PCR-cyclusnummers (28, 31 en 34 cycli). Versterkte PCR producten werden geladen op 1% TBE-agarose gels en gescheiden met 100 V gedurende 60 min., De gewenste producten van ~ 710 bp werden geëxtraheerd zoals hierboven beschreven, werden de rangschikkende bibliotheken voorbereid volgens de Illumina TruSeq DNA – steekproefvoorbereidingsgids en 2 × 250 basis paired-end reads werden gerangschikt gebruikend het Illumina MiSeq platform.
Bioinformatische analyse van gepaarde antilichaam zware en lichte keten repertoires
Demultiplexing van 2 × 250 basis gepaarde einde reads van het miseq sequencing platform werd uitgevoerd op basis van adapter indices en sequencing data werden verkregen in fastq formaat., Slechts lezen met minimum Phred-kwaliteitsscores van 10 meer dan 50% van alle nucleotiden werden behouden en gescand op IgM, IgG, en IgK constante gebiedsequenties. Lees paren die constante gebiedsequenties ontbraken of die HC-HC of LC-LC structuur tonen werden uitgefilterd en de resterende leest werden omgezet in fastq formaat en gebruikt als input voor analyse met MiXCR (v1.2) voor uitlijning van Leest aan verwijzing V(D)J en c gensequenties van de IMGT-database , extractie, en het clusteren van CDR-H3 nucleotide (aanvullend dossier 1: tabel S1)., HC-CDR3 sequenties met frameshifts of stop codons en met minder dan twee reads werden uitgefilterd. We creëerden een HC-LC pairing statistics file om het gepaarde VH-VK gengebruik in het totale gepaarde HC-LC genrepertoires aan te tonen. Warmtekaarten werden gegenereerd met behulp van R en grafisch weergegeven met behulp van ggplot2. Vervolgens werden inter-individuele TT-specifieke HC-CDR3-sequenties geà dentificeerd door HC-CDR3-aminozuursequenties verkregen uit de post-TD booster immunisatiesteekproef te vergelijken met eerder gerapporteerde TT-specifieke HC-CDR3-sequenties .,
PCR-amplificatie van volledige HC-en LC-sequenties
We ontwierpen een tweestaps PCR-gebaseerde amplificatiemethode (aanvullend dossier 1: Figuur S5) om restrictieverteringsplaatsen op te nemen tot potentieel TT-specifieke HC en LC met volledige V(D)J-gensequentie. Dit liet efficiënt klonen van HC en LC opeenvolgingen in respectieve uitdrukkingsvectoren evenals productie van recombinante antilichamen voor in vitro bindende studies toe., In het kort selecteerden we 14 gepaarde HC-LC CDR3 clonotypes die werden verkregen door IgG-sequencing post-TD booster immunisatie op basis van hun frequentie, pairing nauwkeurigheid en vouwverschil tussen top1 LC-CDR3 en top2 LC-CDR3 gekoppeld aan de gegeven HC-CDR3 sequentie. We extraheerden totaal RNA uit bevroren B-cellen geïsoleerd uit post-TD booster immunisatie met behulp van trizol reagens (Ambion) zuivering volgens de instructies van de fabrikant. In de eerste stap, RT-PCR versterking voor elk geselecteerd HC – en LC-CDR3 clonotype werd afzonderlijk uitgevoerd met behulp van de DART 1-stap RT-PCR kit (Roboklon)., De RT – PCR-MasterMix (25 µL) bevatte genspecifieke forward primers van HC en LC V met uitsteeklengtes op de beperkingsplaats van BssHII, samen met individuele CDR3-specifieke omgekeerde primers met 18 nucleotiden van het FR4-gebied bij 0,4 µM-concentraties (aanvullend dossier 1: tabel S3 en figuur S5), 1× Dart-1-stap RT-PCR-masterbuffermix, 1× Dart-masterenzym-mix en 4,5 ng totaal RNA., De thermocyclingomstandigheden waren als volgt: omgekeerde transcriptie bij 55 °C gedurende 30 min, initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min, vervolgens 23 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 20 s, gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. RT-PCR producten werden gezuiverd met behulp van de Agencourt AMPure XP-PCR reinigingskit (Beckman Coulter) volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in 6 mM Tris-Cl pH 8,0., In de tweede stap, werden de gezuiverde RT-PCR producten gebruikt als malplaatje voor PCR versterking gebruikend de polymerase van Q5 high-fidelity DNA (New England Biolabs). De geneste PCR-MasterMix (50 µL) bevatte voorwaartse primers die coderen voor een bsshii-beperkingsplaats en drie nucleotiden van HC-of LC-kiemlijngensequentie, samen met omgekeerde primers die het volledige FR4-gebied en nhei/HindIII-restrictie-overhangen bevatten bij concentraties van 0,4 µM (aanvullend dossier 1: tabel S3 en figuur S5), 4 µL gezuiverd DNA, 200 µM dNTP-mix, 1× Q5-reactiebuffer en 0.,02 u / µL Q5 high-fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs). De thermocyclingomstandigheden waren als volgt: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 3 min, vervolgens 16 denaturatiecycli bij 98 °C gedurende 30 s, gloeien bij 69 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. PCR-producten werden gescheiden op een TBE-agarose gel, HC-en LC-amplicons met restrictieverteringsplaatsen werden uit de gel geëxtraheerd met behulp van de ZYMOCLEAN Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) en producten werden bewaard bij − 20 °C tot verder gebruik.,
klonen en expressie van recombinant monoklonale antilichamen
Restrictievertering van HC-en LC-inserts en expressievectoren over de volledige lengte (pCMV-CD30-4IE3_HC en pCMV-CD30-4IE3_LC) werd uitgevoerd met de restrictie-enzymen BssHII, NheI en HindIII (New England Biolabs). De resulterende producten werden geladen op 2% TBE-agarose gels en banden van ~ 5,9 kb voor de HC Vector backbone, 5.3 kb voor de LC Vector backbone, ~ 370 bp voor HC inserts, en ~ 340 bp voor LC inserts werden grootte-geselecteerd op agarose gels en gezuiverd zoals hierboven beschreven., Ligaties van de overeenkomstige inserts en vectoren voor de versterkte HC en LC clonotypes werden uitgevoerd met behulp van instant sticky-end DNA ligase (New England Biolabs) en omgezet in one-shot chemisch bevoegde E. coli TOP10 cellen (IBA) volgens de instructies van de fabrikant. Plasmide DNA ‘ s werden geà soleerd uit getransformeerde kolonies (8-16 kolonies) met behulp van de qiaprep spin miniprep kit (Qiagen); gelijkenissen met de consensus sequenties werden bevestigd met behulp van capillaire Sanger sequencing., De opeenvolgingen van HC en LC plasmidedna die het dichtst aan de consensusopeenvolgingen pasten werden mede-getransfecteerd in menselijke embryonale niercellijn HEK 293 t (ATCC, CRL-11268) cellen. HEK 293 T cellen werden gekweekt met behulp van rijke glucose (4,5 g/L D-glucose) Dulbecco ’s Modified Eagle’ S Medium (Gibco BRL) aangevuld met warmte-geïnactiveerde ultra-lage IgG foetaal runderserum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicilline, en 100 µg/mL streptomycine. Gezuiverde plasmide-DNA ‘ s voor gepaarde HC-en LC-clonotypen werden samengetransfecteerd in 85-95% confluente HEK 293 T-cellen met behulp van PEI (polyethyleenamine, Polysciences)., Vier dagen na transfectie werden kweeksupernatanten verzameld en TT-antigeenspecifieke clonotypen werden geïdentificeerd door middel van indirecte ELISA.
Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)
we hebben indirecte ELISA assays uitgevoerd om mAbs afgeleid van de geïmmuniseerde proband binding aan TT antigeen te identificeren met behulp van transfected cell culture supernatants. Nunc-Immuno MicroWell 96-wells vaste platen (Thermo Fisher Scientific) werden gecoat met 100 µL 10 µg/mL TT antigeen (Statens Serum Institute, Kopenhagen, Denemarken) in 50 mM carbonaatbuffer pH 9.,6, ‘ s nachts geïncubeerd bij 4 °c, drie keer gewassen met PBS, en Geblokkeerd met 2% vetvrije gedroogde melk (Bio-Rad) in PBS gedurende 150 minuten bij kamertemperatuur. Na blokkering werden 120 µL 1: 2 serieel verdunde transfecteerde supernatanten in PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% vetvrije gedroogde melk) toegevoegd aan de putjes, 350 ng anti-TT mAb (GeneTex) bij muizen werd toegepast op een goed als een positieve controle, en platen werden geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Platen werden drie keer gewassen met PBS-T (0.,1% Tween-20) en 50 µL van een 1:2000 verdunning van geit-anti-mens-kappa-LC-HRP secundair antilichaam (Thermo Fisher Scientific) werden toegevoegd aan de putten, 50 µL van een 1:2000 verdunning van de geit anti-muis IgG-HC-HRP secundair antilichaam (Sigma #A0168) werden toegevoegd aan de positieve controle goed, platen werden geïncubeerd gedurende 2 min bij kamertemperatuur en drie keer gewassen met PBS-T. Voor de kleur van de ontwikkeling, we toegevoegde 50 µL van de one-step Ultra TMB-ELISA substraat (Thermo Fisher Scientific) per goed, geïncubeerd de platen voor 5 min op kamertemperatuur, en stopte de Ag:Ab binding reactie door toevoeging van 50 µL 2 M H2SO4., De absorptie werd gemeten bij 450 nm met behulp van het GloMax Multi Detection System (Promega). ELISA-tests voor alle clonotypen werden uitgevoerd in drievoud, de waarden werden genormaliseerd om achtergrondsignalen te verwijderen en fouten werden weergegeven als standaardafwijkingen van het gemiddelde.
analyse van chimerische ampliconvorming tijdens geneste PCR
Vier gedefinieerde HC-LC-ampliconen werden gegenereerd door de HC en LC uit de respectieve pcmv-plasmiden te versterken (zie hierboven) en door gebruik te maken van een PCR-assemblagereactie om de vier verschillende HC-LC-assemblages te genereren., HC en LC plasmide DNA ‘ s werden gebruikt als templates voor PCR versterking van de TOP1, Top2, Top3, en Top4 klonale keten paren gebruikend primers specifiek voor de respectieve VH en VK genfamilies en IgG en IgK constante gebieden (aanvullend dossier 1: tabel S2 en figuur S6a). Gezuiverd plasmide-DNA (10 ng) werd toegevoegd aan elke 25 µL PCR-reactie met 0,4 µM van elke primer, 200 µM dNTP-mix, 1× Q5 reactiebuffer en 0,2 u/µL Q5 high-fidelity DNA-Polymerase., Thermische cycli werden uitgevoerd met initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 3 min, gevolgd door 25 denaturatiecycli bij 98 °C gedurende 30 s, gloeien / verlenging bij 71 °C gedurende 1 min (voor HC plasmide DNA) of gloeien bij 64 °C gedurende 1 min en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min (voor LC plasmide DNA), gevolgd door een laatste uitbreidingsstap bij 72 °C gedurende 5 min. PCR-producten werden geladen op afzonderlijke 1% TBE-agarose gels en gescheiden met 100 V gedurende 60 minuten. De gewenste DNA-producten van ~ 400 bp (voor HC) en ~ 350 bp (voor LC) werden op maat geselecteerd en geëxtraheerd uit de gel zoals hierboven beschreven., De gezuiverde HC en LC PCR producten werden gebruikt als sjablonen voor HC en LC assemblage door overlapping uitbreiding PCR (extra bestand 1: Figuur S6b). Kort, 5 ng van elke HC en overeenkomstige gepaarde LC DNA werden toegevoegd aan elke 50 µL PCR reactie met 1× Dart 1-stap RT-PCR master buffer (Roboklon), 2× dART master enzym (Roboklon), en 0,4 µM van elke IgG en IgK constant region primer (aanvullend dossier 1: tabel S2)., Thermische cycli werden uitgevoerd met RT-inactivatie bij 95 °C gedurende 3 min, gevolgd door drie denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 20 s, gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 2 min, gevolgd door 25 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 20 s, gloeien bij 56 °C gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 4 min, gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. De montageproducten werden op 1% TBE-agarose gels geladen en gedurende 45 minuten met 100 V gescheiden. De assemblageproducten van ~ 750 bp werden op maat geselecteerd en geëxtraheerd uit de agarose gel zoals hierboven beschreven., De individueel geassembleerde HC-LC klonale paren werden samengevoegd en gebruikt als sjabloon voor geneste PCR versterking met primers specifiek voor IgG en IgK constante gebieden (aanvullend dossier 1: tabel S2, figuur S6C). De geneste PCR-reactie en thermische cyclische omstandigheden waren hetzelfde als beschreven in de sectie “geneste PCR-versterking van menselijke B-cel assemblageproducten”, behalve dat de PCR-versterking gedurende 25 cycli werd uitgevoerd. PCR-produkten werden geladen op 1% TBE-agarose gels, gescheiden met 100 V gedurende 60 minuten en gewenste produkten van ~ 720 bp werden geëxtraheerd zoals hierboven beschreven., Het rangschikken van bibliotheken van de individuele samenstellingen en van de gemengde samenstellingen na geneste PCR werden voorbereid volgens de de steekproefvoorbereidingsgids van Illumina TruSeq van DNA en 2 × 250 basis paired-end reads werden geproduceerd gebruikend het platform Illumina MiSeq.