Wat is PCR? – De Beginnershandleiding

PCR is de techniek van moderne laboratoria voor Moleculaire Biologie. Als u DNA moet kopiëren , sequencen of kwantificeren , moet u PCR kennen. In het kort, is PCR (polymerasekettingreactie) een biochemische techniek die thermocycling en enzymen gebruikt om snel en betrouwbaar DNA te kopiëren, en het werd uitgevonden in een flits van inspiratie door een wetenschapper die op snelweg 128 van San Francisco aan Mendocino rijdt.,

Dit artikel geeft een kort, basisoverzicht van PCR, met een paar tips om u te helpen de meest voorkomende valkuilen te vermijden. Als u nieuw bent, of relatief nieuw aan PCR dan is dit voor u. (En zelfs als je ervaring op PCR is het zeker de moeite waard om te lezen om te vernieuwen, en misschien pak een tip of twee!).

Basispcr ingrediënten:

Polymerase

polymerasen zijn enzymen die onder de juiste omstandigheden nieuwe DNA-strengen kunnen samenstellen uit template-DNA en nucleotiden. De originele PCR-reactie was omslachtig omdat de hoge temperaturen nodig om DNA te denatureren de polymerasen zouden doden., Dit betekende dat na elke verwarmingscyclus nieuwe polymerasen handmatig aan de reactie moesten worden toegevoegd– een dure onderneming. Nochtans in moderne PCR is dit geen probleem, aangezien de polymerasen die in moderne PCR worden gebruikt gewoonlijk van één van twee thermofiele bacteriebronnen, Thermus aquaticus of Pyrococcus furiosus komen. Deze polymerasen, respectievelijk, Taq (uitgesproken “tack”) en Pfu (uitgesproken “P-F-U”) zijn gemakkelijk bestand tegen de hoge temperaturen geassocieerd met een PCR-reactie., Commerciële Taq en Pfu polymerases zijn ontworpen voor snelheid, trouw, processiviteit (vermogen om te voltooien lange leest), en hun vermogen om GC rijke sjablonen te lezen. Bedrijven komen voortdurend met nieuwe polymerasen. Daarom, regelen niet voor “wat in uw diepvriezer” is, maar winkel rond voor de beste commerciële polymerase voor uw PCR behoeften. Praat ook met uw lokale vertegenwoordiger, omdat ze vaak gratis polymerase monsters kunnen geven, zodat u kunt beslissen wat het beste is voor u.

sjabloon DNA

Dit is het DNA waarop u uw primers ontwerpt., Het is het DNA dat uw polymerase zal lezen en kopiëren. Uw template-DNA kan genomisch, plasmide of cDNA zijn, maar wat uw bronkwaliteit ook telt. Hoe meer intact en zuiverder uw template DNA hoe gemakkelijker het is om goede PCR resultaten te krijgen. Houd ook in gedachten de ideale hoeveelheid DNA zal afhangen van uw bron, gewoonlijk 1 pg – 1 ng plasmide DNA of 1 ng – 1 µg genomic DNA per PCR-reactie.

Primers

Primers zijn korte fragmenten van gesynthetiseerd DNA die zich binden aan uw template-DNA. U moet een “forward” primer en een “reverse” primer ontwerpen., Uw forward primer geeft het begin van uw PCR aan. De volgorde van deze primer is dezelfde als die van je 5-3 template DNA. Uw reverse primer geeft het einde van uw PCR aan. De volgorde van deze primer is de omgekeerde complement van je template DNA. In het algemeen zijn primers 18-22 basisparen lang. Echter, belangrijker dan hun lengte is de smelttemperatuur van uw primers. De smelttemperatuur van uw primers moet 54-60°C zijn en zo veel mogelijk op elkaar lijken., Er zijn veel online rekenmachines die primer gloeiende temperaturen kunnen berekenen, en de meeste bedrijven die primers synthetiseren leveren dergelijke rekenmachines.

nucleotiden

als monomeren van DNA zijn nucleotiden noodzakelijk voor het maken van DNA-kopieën. Voor de meeste DNA-PCR ‘ s gebruikt u Deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs). U kunt deze afzonderlijk of als een dgtp, dCTP, dATP en dTTP mix kopen. Wat je ook koopt, houd er rekening mee dat nucleotiden zeer gevoelig zijn voor bevriezen/ontdooien cycli. Daarom is het het beste om altijd kleine aliquots van je dntp ‘ s te maken., Zorg er ook voor dat u ze goed opslaat – gebruik geen vorstvrije vriezer die door automatische ontdooicycli gaat.

Buffer

De meeste commerciële polymerasen worden geleverd met hun ideale buffer. Deze buffers leveren niet alleen de juiste pH, maar ze hebben altijd additieven zoals magnesium, kalium of DMSO, die helpen bij het optimaliseren van DNA-denaturering, renaturering en polymeraseactiviteit. Er zal meer over deze additieven in een volgend artikel.

Thermocycling:

hier gebeurt de magie., Alle bovenstaande ingrediënten worden toegevoegd aan een PCR buis en de buis is thermocycled. Om thermocycling te bereiken toen PCR voor het eerst werd uitgevonden, werden individuele PCR-buizen handmatig verplaatst tussen verwarmde waterbaden. (En je denkt dat je bankwerk vervelend is!) Nu, dankzij de uitvinding van “Mr. cycli”, de eerste thermocycling machine, temperatuurregeling wordt nu automatisch gedaan door thermocyclers. Het volgende is een typisch PCR-thermocyclerprofiel:

initialisatie

in deze stap wordt de reactie gedurende 30 seconden tot enkele minuten verhit tot 94-96°C., Deze stap wordt gewoonlijk slechts één keer gedaan in het begin van uw PCR-reactie. Deze stap is belangrijk voor het activeren van hot-start polymerases, als u gebruik maakt van een dergelijke polymerase, en om uw template DNA denatureren. Houd er rekening mee dat als uw sjabloon GC-inhoud hoog is, u mogelijk een extra lange initialisatiestap moet uitvoeren.

denaturatie (15-40 maal herhaald)

in deze stap wordt de reactie gedurende 15-30 seconden verhit tot 94-98°C. Deze stap denatureert je DNA en primers, waardoor ze in de volgende stap aan elkaar kunnen ontharden.,

gloeien (15-40 keer herhaald)

in deze stap wordt de temperatuur van uw reactie snel verlaagd tot 50-64°C gedurende 20-40 seconden. De temperatuur in deze stap moet laag genoeg zijn dat uw gedenatureerde primers Watson-Crick basenparen kunnen vormen met uw template DNA. Maar hoog genoeg dat alleen de meest stabiele (perfect gepaarde) dubbelstrengs DNA-structuren zich kunnen vormen. Meestal is deze perfecte gloeitemperatuur een paar graden lager dan de smelttemperatuur van uw primerpaar. Ook tijdens deze stap zal uw polymerase zich binden aan uw primer/template DNA complex., Hoewel uw polymerase niet zal beginnen met lezen totdat de temperatuur is verhoogd in de volgende stap.

verlenging of verlenging (15-40 keer herhaald)

In deze stap wordt uw reactie snel verhit tot 72-80°C. Dit is het moment waarop uw polymerase begint met het lezen (in de 5-3 richting) en het kopiëren van uw template DNA (in de 3-5 richting). De hogere temperatuur tijdens deze stap vermindert niet-specifieke primer/template DNA interacties, waardoor de specificiteit van uw reactie toeneemt., De exacte temperatuur wordt echter bepaald door de voorkeur van uw polymerase, dus lees uw verpakking. De lengte van deze stap hangt af van hoe lang uw DNA-kopie zal zijn. Typisch, kan de polymerase van DNA 1.000 basisparen per minuut kopiëren. Daarom moet u ten minste 1 minuut verlengtijd per 1.000 bases toestaan. Aan het einde van deze incubatie zullen nieuwe dubbelstrengs stukken DNA zijn gecreëerd, bestaande uit zowel template als nieuw DNA.

stap 2-4 wordt dan 15-40 keer herhaald

Het is waar dat hoe meer cycli u programmeert, hoe meer DNA-kopieën u maakt., Er is echter een bovengrens. Op een bepaald punt worden de beschikbare vrije nucleotiden beperkend en de voortijdig afgeknotte exemplaren van DNA kunnen een probleem worden. Dus word niet hebberig met je fietsen. Minder maar goed schoon PCR-product heeft de voorkeur aan veel vuil product.

uiteindelijke verlenging

Dit is een optionele maar vaak aanbevolen stap. In deze stap wordt de reactie gehouden bij 70-74°C gedurende enkele minuten. (Meestal gebruikt u dezelfde temperatuur als bij de rek-of Verlengstap.) Deze stap staat de polymerasen toe om het lezen te beëindigen van welke bundel zij momenteel op zijn., Deze optionele stap kan helpen het aantal afgeknotte kopieën in uw eindproduct te verminderen.

Final hold

uw reactie is nu voltooid. Aangezien het hele proces een paar uur kan duren, worden PCR-reacties vaak ‘ s nachts of wanneer u anders bent weggegaan gedaan; het is raadzaam dat u uw thermocycler programmeert om uw PCR-product op 4°C te houden totdat u terugkeert. Op dat moment kunt u uw product analyseren of gebruiken, of overbrengen naar meer geschikte opslag op lange termijn, zoals uw koelkast.

veel succes en veel plezier met PCR-ing!