Beschreibung
Pierce BCA Protein Assay Kit ist ein zweikomponentiger, hochpräziser, waschmittelkompatibler Protein Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Die meisten BCA-Reagenzien bieten eine genaue Bestimmung der Proteinkonzentration bei den meisten Probentypen, die in der Proteinforschung anzutreffen sind. Der Pierce-BCA-Assay kann verwendet werden, um Erträge in ganzen Zelllysaten, Affinitätssäulen-Fraktionen, gereinigten Proteinproben zu bewerten sowie Proteinkontamination in industriellen Anwendungen zu überwachen., Im Vergleich zu den meisten Farbstoffbindungsmethoden wird der BCA-Assay viel weniger durch Proteinzusammensetzungsunterschiede beeinflusst, was eine höhere Konzentrationsgenauigkeit bietet.,—Bindungsmethoden (Bradford)
• Kompatibilität-unbeeinflusst von typischen Konzentrationen der meisten ionischen und nichtionischen Detergenzien
• Assay—Zeit-30—min Inkubation; viel einfacher und viermal schneller als klassische Lowry—Methoden
• Assay-Bereich-linearer Arbeitsbereich für BSA von 20 bis 2000 µg/ml
• Empfindlichkeit-detect bis zu 5 µg/ml mit verbessertem Protokoll
Wie der Assay funktioniert
Der BCA-Protein-Assay kombiniert die bekannte Reduktion von Cu2+ auf Cu1+ durch Protein in ein alkalisches Medium mit dem hochempfindlichen und selektiven kolorimetrischen Nachweis des Cuprous-Kation (Cu1+) durch Bicinchoninsäure (BCA)., Der erste Schritt ist die Chelatisierung von Kupfer mit Protein in einer alkalischen Umgebung, um einen hellblauen Komplex zu bilden. Bei dieser Reaktion, die als Biuret-Reaktion bekannt ist, bilden Peptide, die drei oder mehr Aminosäurereste enthalten, einen farbigen Chelatkomplex mit Cuprionen in einer alkalischen Umgebung, die Natriumkaliumtartrat enthält.
Im zweiten Schritt der Farbentwicklungsreaktion reagiert BCA mit dem reduzierten (cuprous) Kation, das in Schritt eins gebildet wurde. Das intensive purpurfarbene Reaktionsprodukt resultiert aus der Chelatbildung von zwei BCA-Molekülen mit einem Cuprous-Ion., Der BCA / Kupfer-Komplex ist wasserlöslich und weist eine starke lineare Absorption bei 562 nm mit zunehmenden Proteinkonzentrationen auf. Der Komplex ist ungefähr 100 mal empfindlicher (untere Nachweisgrenze) als die hellblaue Farbe der ersten Reaktion.
Die Reaktion wird stark von vier Aminosäureresten (Cystein, Cystin, Tyrosin und Tryptophan) in der Aminosäuresequenz des Proteins beeinflusst., Im Gegensatz zu Coomassie-Farbstoffbindungsmethoden trägt das universelle Peptid-Rückgrat jedoch auch zur Farbbildung bei und trägt dazu bei, die durch Proteinzusammensetzungsunterschiede verursachte Variabilität zu minimieren.