„Die RNA-Sequenzierung ist eine Sequenzierungsmethode der nächsten Generation mit hohem Durchsatz, die zur Analyse von Genexpressions-und Transkriptomikstudien verwendet wird.“
Ribonukleinsäure ist eine Art von Nukleinsäure, die hauptsächlich an der Genexpression, Genregulation und Kodierung/Dekodierung von Informationen beteiligt ist.
mRNA-Messenger-RNA ist eine kodierende Sequenz eines Gens, das an der Proteinsynthese beteiligt ist, ungefähr 4% des RNA-Pools bestehen aus mRNA, während andere nicht kodierende RNAs sind.,
Obwohl etwa 90% der RNA nicht kodiert sind, sind diese für die Ausführung verschiedener Funktionen wichtig.
Zum Beispiel
- tRNA – überträgt die Aminosäure an die ribosomale Stelle, während die Übersetzung.
- rRNA – ribosomale RNA-hilft bei der übersetzung.
- microRNA-Genexpression und Regulation der Genexpression.
- siRNA-schützt eine Zelle vor den exogenen RNAs.
Eine mRNA ist eine einzelsträngige Nukleinsäure, die aus einem Gen transkribiert wird und aus der das Protein übersetzt wird.,
Die mRNA oder das Transkript enthält nur die kodierenden Sequenzen eines Gens. Somit besitzt es nur die Sequenzen, die bei der Proteinbildung benötigt werden.
Fortan kann durch die Analyse einer mRNA das Expressionsmuster des verwandten Gens bestimmt werden.
Außerdem gibt uns die Gesamt-RNA-Untersuchung eine Vorstellung davon, welche Gene mit der Proteinbildung verbunden sind und welche nicht.
Bedeutet, dass die Menge an Gesamt-RNA, mRNA und ncRNA durch Untersuchung der Gesamt-RNA bestimmt werden kann.,
Transkriptomik ist die Untersuchung der gesamten mRNA-oft als Transkriptome oder Gesamt-RNA in einer Zelle oder Zellpopulation bezeichnet.
Durch die Analyse des Transkriptoms einer Zelle kann der gesamte Pool der Genexpression untersucht werden. Eine der wichtigsten Techniken, die in transkriptomischen Studien verwendet werden, ist die RNA-Sequenzierung.
Das Transkriptom eines Organismus ist im Gegensatz zum Genom größer, komplexer und unsicherer.
Das Transkriptom variiert in verschiedenen Zuständen und in einer anderen Umgebung., Lebensstil, Ernährung, Bewegung, Umwelt, Bedingungen und andere externe Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Transkriptomregulation.
Hier wird in der RNA-Sequenzierung die aus der mRNA synthetisierte cDNA sequenziert und in einem Sequenzer quantifiziert. Im vorliegenden Artikel werden wir nur die RNA-Sequenzierung diskutieren, aber vorher lesen Sie unseren vorherigen Artikel über Transkriptomik: Was ist Transkriptomik?,
Schlüsselthemen:
Prinzip der RNA-Sequenzierung:
Die RNA-Sequenzierung ist eine RNA-Sequenzierungs-und Quantifizierungsmethode der nächsten Generation, die zur Untersuchung der Transkriptomik und Genexpression mit hohem Durchsatz verwendet wird.
Eine cDNA wird aus Gesamt-mRNA durch den Prozess der umgekehrten Transkription aufgebaut und fragmentiert. Simultane, Adapterligation und Bibliotheksvorbereitung werden vor der Sequenzierung geübt.
Der Sequenzer liest und quantifiziert die cDNA komplementär zur mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
Die Isolierung von RNA ist im Vergleich zur DNA-Isolierung ein langwieriger Prozess. Die RNA kann leicht zerstört werden. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination bei der RNA-Isolierung hoch.
Daher muss bei der Isolierung von RNA besondere Vorsicht walten gelassen werden, und dazu ist fachkundige Hilfe erforderlich.
Hohe Ausbeute reine RNA ist für die RNA-Sequenzierung erforderlich.
Die Reinheit und Quantität der RNA wird mit dem Nanodrop oder Qubit gemessen.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
Jetzt unsere RNA-Probe ist bereit für den nächsten Schritt.,
Reverse Transkriptase PCR:
Eine weitere innovative Einrichtung für die RNA-Sequenzierung besteht darin, reverse Transkriptase PCR durchzuführen, bei der die RNA reverse in DNA transkribiert wird.
Unter Verwendung einer speziellen Art von Polymerase, die als DNA-Reverse-Transkriptase bekannt ist, wird die cDNA aus der mRNA synthetisiert.
Erfahren Sie mehr über RT-PCR-hier: Reverse-Transkriptase-PCR.
Zweite Strang-cDNA-Synthese:
Nach der aus der mRNA synthetisierten cDNA ist die zweite Strang-DNA-Synthese erforderlich. Dazu wird die PCR unter Verwendung der normalen Taq-DNA-Polymerase in konventioneller PCR durchgeführt.,
Die Polymerase fügt dem wachsenden DNA-Strang unter Verwendung des Primersatzes dNTPs hinzu.
Bibliotheksvorbereitung:
Der erste Schritt in der Bibliotheksvorbereitung oder NGS Bibliotheksvorbereitung beginnt mit den Fragmentierungen.
Unter Verwendung der speziellen Art von Restriktionsendonukleasen wird der gesamte Satz von DS-cDNA für die NGS fragmentiert.
Hinweis:
Die Bibliotheksvorbereitung variiert von Plattform zu Plattform, da einige mRNA vor der Durchführung der Reverse-Transkriptase fragmentieren, während andere sie später nach der Herstellung der cDNA durchführen.,
Im letzten Schritt der Bibliotheksvorbereitung werden die Enden mit den Adaptersequenzen ligiert und zur Reparatur der Enden verstärkt. dA-Tailing ist optional im Falle einer mRNA-Bibliothek.
Bibliotheksreinigung:
Die gesamte Bibliothek wird mit dem gebrauchsfertigen DNA-Reinigungskit gereinigt.
Im letzten Schritt ist es sehr wichtig, die gesamte Fragmentbibliothek zu reinigen, damit die Konzentration der Bibliothek mit dem quantitativen PCR oder Bioanalysator bewertet wird.,
Hinweis:
Für einen Anfänger denke ich, dass Bibliotheksvorbereitung und DNA-Fragmentierung sehr schwer zu verstehen sind, daher sollten wir einen ganzen Artikel über genomische DNA-Fragmentierung, Bibliotheksvorbereitung und ihre Bedeutung in NGS schreiben.
Wie auch immer, gehen wir weiter,
Im nächsten Schritt wird die Probe fragmentierter DNA zur Sequenzierung gesendet.
DNA-Sequenzierung:
Nun wird die Probe in der NGS-Maschine mit hohem Durchsatz sequenziert, die die Sequenz liest und auch die Nukleinsäure quantifiziert.,
Die Chemie hinter der Sequenzierung der cDNA hängt davon ab, welche Plattformen wir verwenden, obwohl die weit verbreitete Methode die Verwendung von Fluoreszenzchemie ist.
Im Sequenzer werden einzelne Fragmente getrennt „gelesen“ und sequenziert. Die endgültigen Daten werden zur Postsequenzierungsanalyse an das Bioinformatiklabor gesendet.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | Kleine Haarnadel RNA | Synthetisches RNA-Molekül hilft bei der Genregulation und Kontrolle der Genexpression. |
Transkriptomdatenanalyse:
Einer der langwierigen Jobs, wie wir bereits im vorherigen Artikel besprochen haben, ist die Transkriptomdatenanalyse und Interpretation der Ergebnisse. NGS-Daten sind riesig und komplexer.,
Ehrlich gesagt ist das Lehren der Datenanalyse der Transkriptomik nicht möglich, man sollte praktische Übungen machen müssen, um zu lernen, dennoch werde ich versuchen, Ihnen beizubringen, was als nächstes in diesem Prozess passiert.
In der Maschine werden verschiedene Fragmente sequenziert und Daten gesammelt. Im nächsten Schritt werden basierend auf dem flankierenden Bereich der Fragmente die sogenannten „Contings“ angeordnet, um Spleißvarianten zu erhalten.
Im nächsten Schritt wird das Transkriptom mit der Referenzsequenz verglichen oder kann de novo zusammengesetzt werden.,
Eine kurze übersicht über den gesamten Prozess der RNA-seq.
Gesamte Transkriptomsequenzierung:
Das gesamte Transkriptom einer Zelle oder eines Gewebes-alle RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA und siRNA) werden sequenziert und quantifiziert. Mit anderen Worten, wir können sagen, sowohl Romane als auch bekannte Transkripte können sequenziert werden.
Dazu wird der gesamte Satz von RNA aus der Gewebeprobe extrahiert.,
Ziel – RNA-Sequenzierung:
In der zielspezifischen RNA-Sequenzierung werden genspezifische, Cluster von genspezifischen, wegspezifischen oder krankheitsbezogenen Transkriptomen sequenziert.
Die Ziel – RNA-Sequenzierung ist erschwinglicher und genauer als die gesamte Transkriptomsequenzierung. Darüber hinaus ist weniger Menge an RNA-Probe für das Experiment erforderlich.
Kleine RNA-Sequenzierung:
Eine der am weitesten verbreiteten Techniken in der RNA-Sequenzierung ist die Untersuchung der kleineren nicht-kodierenden RNA einer Zelle, da diese mit so vielen Funktionen in einem Genom assoziiert sind.,
Kleinere RNA-Moleküle wie miRNA, siRNA und piRNA können durch die NGS-basierte RNA-Sequenzierungsmethode für verschiedene Anwendungen quantifiziert und sequenziert werden.
mRNA-Sequenzierung:
Sequenzieren Sie das gesamte mRNA-Transkript unter Verwendung der Poly (A) – Schwanzauswahl, die für Genexpressionsstudien verwendet wird. Mittels mRNA-Sequenzierung können bekannte sowie neuartige Transkript-Veränderungen nachgewiesen werden.
Vorteile der RNA-Sequenzierung:
Einer der entscheidenden Vorteile der RNA-Sequenzierung besteht darin, dass keine vorherige Sequenzinformation erforderlich ist., Da der gesamte Prozess nicht auf der sondenbasierten Chemie basiert, ist hier keine vorherige Sequenzinformation zur Auslegung der Sonde erforderlich.
Genauere und empfindlichere Genexpressionsstudie kann durchgeführt werden.
Breiterer Dynamikbereich.
Erfassen Sie sowohl bekannte als auch neuartige Änderungen des Transkripts, auch wenn keine Sequenzinformationen verfügbar sind.
Obwohl keine Referenzsequenzinformationen verfügbar sind, kann die RNA-Sequenzierung für jede Spezies angewendet werden.
Bezug: Synthetisches Genom – Methoden, Anwendungen Und Herausforderungen.,
Schlussfolgerung:
Abschließend können wir sagen, dass die RNA seq-Methode im Vergleich zum Microarray fortgeschrittener und genauer ist. Auch De-Novo-Mutationen können damit entdeckt werden.