16S rRNA gensekvensering används ofta för identifiering, klassificering och kvantifiering av mikrober inom komplexa biologiska blandningar såsom miljöprover (ex havsvatten) och tarmprover (ex human gut microbiome)., 16S rRNA-genen är en mycket bevarad komponent i transkriptionsmaskineriet i alla DNA-baserade livsformer och är därför mycket lämpad som en målgen för sekvensering av DNA i prover som innehåller upp till tusentals olika arter. Universal PCR primers kan utformas för att rikta de konserverade regionerna på 16S vilket gör det möjligt att förstärka genen i ett brett spektrum av olika mikroorganismer från ett enda prov. Bekvämt består 16S rRNA-genen av både konserverade och variabla regioner (Fig. 1)., Medan den bevarade regionen gör universell förstärkning möjlig, möjliggör sekvensering av de variabla regionerna diskriminering mellan specifika olika mikroorganismer som bakterier, archaea och mikrobiell eukarya. Identifiering av virus kräver metagenomisk sekvensering (den direkta sekvenseringen av det totala DNA som extraheras från ett mikrobiellt samhälle) på grund av deras brist på fylogenetisk markörgen 16S.
Fig 1 – ungefär 1.5 kb 16S rRNA-genen av E. coli som visar de nio variabla regionerna som gör den till ett idealiskt mål som en fylogenetisk markörgen.,
ursprungligen krävde studier av miljöprover odling och isolering av arter för identifiering, en mödosam och tidskrävande process. Kopplingen av 16S rRNA PCR med nästa generations sekvensering har dock möjliggjort studier av många prover till låg kostnad. Tidiga 16S rRNA-sekvenseringsstudier har redan funnit många sekvenser som inte hör till några kända odlade arter, vilket indikerar att det finns många icke-isolerade organismer och att odlingsbaserade metoder endast finner en liten andel av bakterie-och archaealarterna i ett prov., Dessutom, med multiplexering av många prover och högt täckningsdjup som erbjuds av dagens nästa generations plattformar, kan vi nu analysera prover från omfattande tidsserier för att kvantifiera mikrobiell samhällsdynamik över många platser, eller producera detaljerade 3D-kartor över mikrobiella samhällen, samt utforska om förändringar i sällsynta eller rikliga arter är förknippade med hälsa och sjukdom.
Fig 2 – kluster av 5′ och 3′ läser från olika miljöprover visar att prover från en given miljötyp kluster tillsammans väl.,
läser från nästa generations sekvensering kan sprängas mot kurerade databaser som Ribosomal Database Project (RDP), GreenGenes och SILVA för identifiering och klassificering. Relaterade sekvenser är” grupperade ” och antalet representanter för varje kluster räknas. Kluster av liknande sekvenser kallas” operativa taxonomiska enheter ” (Otus). Otu-räkningar sammanfattas i en tabell med relativa överflöd för varje organism i varje prov., Hittills har flera analyspipelines utvecklats för analys av 16S rRNA-gensekvensdata och två vanliga rörledningar är QIIME och Mothur. QIIME tar användare från sin råa sekvenseringsutgång genom initiala analyser som otu-plockning, taxonomisk uppdrag och konstruktion av fylogenetiska träd från representativa sekvenser av OTUs, och genom nedströms statistisk analys, visualisering och produktion av publikationskvalitetsgrafik.,
LC Sciences erbjuder en omfattande 16SrRNA gensekvenseringstjänst för identifiering och klassificering av arter i mikrobiella prover. Vi använder en dual zone (amplified zones V3 + V4) 16S rDNA fragment amplification strategy, sekvens på branschledande Illumina MiSeq plattform och ger omfattande dataanalys inklusive: sekvensering datautgångsstatistik, sekvens kluster i operativa taxonomiska enheter (OTU), mångfald analys, Art klassificering och överflöd analys.,
nyligen använde en av LC Sciences kunder 16S rRNA gensekvensering för att studera luft mikrobiell förökning i förorenade områden där ogynnsamma väderförhållanden orsakar en dubbel förorening av damm och smog.