GLP-1 och insulinsekretion
översikt över den ATP-känsliga vägen.
Glukosstimulerad insulinsekretion (GSIS) regleras av ett antal joniska och nonjoniska signalvägar, även kända som KATP-beroende och oberoende vägar (34,35). Den KATP-beroende mekanismen för stimulus-sekretionskoppling ses över i Fig. 1., I allmänhet anpassar p-cellen insulinsekretionen till rådande blodsockernivåer genom glukosmetabolism. När glukosnivåerna stiger ökar graden av glykolys, vilket genererar substrat (huvudsakligen pyruvat) för mitokondriell oxidativ metabolism, vars resultat är generering av ATP, eller mer korrekt en ökning av ATP-till-ADP-förhållandet (36). Denna händelse ger den funktionella länken mellan en glukosstimulans och insulinsekretion., Ökningen i detta förhållande orsakar stängning Av β-cell-KATP-kanaler, vilket leder till plasmamembrandepolarisering, aktivering av spänningsberoende Ca2+-kanaler (VDCCs) och en ökning av den intracellulära koncentrationen av Ca2+ (i), den främsta utlösaren för insulinsekretion. Repolarisering av β-celler medieras sannolikt av spänningsberoende k+(Kv) kanaler och Ca2+-känsliga spänningsberoende k+(KCa) kanaler (37), som öppnas som svar på glukosinducerad membrandepolarisering för att återställa det yttre flödet av K+., GLP – 1 föreslås att modulera GSIS genom att reglera aktiviteten hos flera jonkanaler som är involverade i KATP-beroende insulinsekretion samt steg distal till kanalmodulering.
GLP-1 och β-cell KATP-kanaler.
en av de många observerade cellulära effekterna av GLP-1 är hämningen av β-cell KATP-kanaler (38-40). Den resulterande membrandepolariseringen inducerad av KATP – kanalförslutning initierar Ca2+ tillströmning genom vdccs och utlöser den exocytotiska frisättningen av insulin., Figur 2 visar den excitatoriska effekten av GLP – 1 på membranpotentialen och dess hämmande effekt på både infödda KATP-kanalströmmar från ins-1-celler och strömmar medierade av rekombinanta KATP-kanaler (SUR1 / Kir6.2) samuttryckt med GLP-1-receptorn i en däggdjurscelllinje. De fysiologiska konsekvenserna av GLP-1-underlättad KATP – kanalförslutning skulle vara att 1) öka excitabiliteten hos celler som redan ligger över tröskeln för insulinfrisättning och 2) öka andelen β-celler som aktivt utsöndrar insulin vid glukoskoncentrationer normalt subthreshold för frisättning av insulin.,
Den allmänna uppfattningen är att den hämmande effekten av GLP-1 på KATP-kanaler är cAMP/PKA-beroende (38-41), även om en studie med råtta β-celler ogillar (42). Detta påstående av Suga et al. (42) bygger på deras konstaterande att den specifika PKA-hämmaren Rp-cAMPS (100 µmol/l) inte kunde förhindra den cellulära depolariseringen och minskningen av hela cellens KATP-ström som framkallats av GLP-1. Fullständigheten av PKA-inhibering av Rp-läger bör ifrågasättas eftersom forskolin i samma studie inducerade signifikant insulinsekretion även i närvaro av RP-läger. För det andra, Suga et al., föreslå att GLP-1 orsakar en liten ökning av KATP-kanalens ATP-känslighet så att KATP-kanalen vid låga mikromolära ATP-koncentrationer blir mer mottaglig för stängning. Emellertid, i den normala råtta pankreas β-cell, är millimolära nivåer av ATP närvarande (43), och vid dessa fysiologiska ATP nivåer, mycket liknande KATP kanal öppen Sannolikhet (Po) i frånvaro och närvaro av GLP-1 förutses enligt följande. Våra beräkningar indikerar att med en intracellulär av 2 mmol/l reduceras KATP-kanalen Po från 0,005 till 0,003 i närvaro av GLP-1., Det är rimligt att ett vänsterskifte av ATP-känslighet uppträder i närvaro av GLP-1. Den observerade storleken på GLP-1-inducerad KATP-strömreduktion ses emellertid i helcelliga plåsterklämningsinspelningar (Fig. 2) är sannolikt för stor för att redovisas enbart av de små minskningarna i Po beräknat från data från Suga et al. (42). Det senaste arbetet från vårt laboratorium har visat att den membranpermeanta specifika PKA-hämmaren h-89 (44) kan helt hämma KATP-strömreduktion med GLP-1 (45)., Dessutom har andra visat liknande resultat med hjälp av RP-8-Br-läger, en mer membranpermeabel analog av RP-läger (38,41). Verkan av GLP-1 på KATP-kanaler kan också innebära andra signalvägar eftersom KATP – kanalinhibering av GLP – 1 i mus β-celler visades vara kalmodulinberoende, med användning av calmodulin-hämmarna W-7 och calmidazolium (46).
glukosberoende av GLP-1-åtgärder har fastställts väl, även om de exakta mekanismerna för detta beroende är oklara (41,47)., PKA: s cellulära åtgärder på KATP-kanalen kan emellertid ge en länk mellan detta Kinas och glukoskänsligheten hos GLP-1. Andra grupper har visat att tillägg av den katalytiska subenheten av PKA (cPKA) för att utskurna plåstren innehåller KATP-kanaler som resulterar i en förstärkning av KATP nuvarande (39,48). Vårt laboratorium har nyligen visat att effekten av cPKA på KATP aktuella är beroende av ADP (45). När ADP-nivåerna är förhöjda ökar cPKA KATP-kanalströmmen i ett rekombinant system, vilket överensstämmer med resultaten av Lin et al. (39)., Omvänt, eftersom ADP-nivåerna minskar, minskar cPKA KATP-strömmen (45). Fysiologiskt kan detta resultera i en försumbar ökning av p-cellens excitabilitet när glukosnivåerna är låga (höga ), medan när glukosnivåerna stiger (låga ), GLP-1-medierad stängning av KATP-kanaler, via en PKA-beroende väg, leder till membrandepolarisering och efterföljande ökningar i β-cellens excitabilitet., Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt det cellulära ATP-till-ADP-förhållandet när man överväger KATP-kanalaktivitet eftersom det är förändringar i detta förhållande, mer än bara förändringar i intracellulär i sig, som styr aktiviteten hos KATP-kanaler i den intakta β-cellen. Fri ATP är mycket buffrad i cellen genom membran och cytosoliska Atpaser (43) och förväntas inte förändras signifikant med ökad glukosmetabolism (36). Däremot är den ömsesidiga förändringen i ADP, som inte buffras i samma utsträckning, mer signifikant och resulterar i en förändring av ATP-till-ADP-förhållandet (36)., Faktum är att betydelsen av ADP vid kontroll av β-cells KATP-kanalaktivitet har visats eftersom mutationer i ADP-avkänningsområdet för den mänskliga KATP-kanalen leder till okontrollerad insulinsekretion och hypoglykemi (49). Den molekylära identiteten hos PKA-fosforyleringsstället är av stor betydelse och är fortfarande under utredning. Både Kir6.,2 och SUR1 underenheter av KATP-kanalen innehåller förmodade målet sekvenser för PKA-medierad fosforylering (39,48), och systematiskt mutation av dessa restprodukter bör klargöra de relativa bidragen från dessa platser till åtgärder av PKA på KATP-kanal.
GLP-1, vdccs och intracellulära Ca2+ butiker.
GLP-1 har visat sig öka strömmar genom VDCCs i mus, råtta och mänskliga β-celler (38,50–52), även om storleken på denna effekt varierar och ofta inte når statistisk signifikans., I enstaka humana β-celler, GLP-1 visades Öka l-typ vdcc aktivitet och amplituden för depolarisation-framkallade intracellulära kalciumtransienter, en effekt som stod för 40% av ökningen av GLP-1-potentierad exocytos (52). Även om L-typ Vdcc är klassiskt betraktas som de viktigaste regulatorer av Ca2+ tillströmning leder till insulinutsöndring, β-celler är kända för att uttrycka flera Ca2 + kanal isoformer (53). Pereverzev et al. (54) rapporterade nyligen att möss som saknar A1E-isoformen av Cav2.3 har minskat glukostoleransen och minskat insulinsvar på glukos., De spekulerar att g-proteinreglering av denna kanal kan modulera insulinsekretion baserat på muskarin acetylkolinreceptorreglering av VDCCs in vitro (55).
Vi har funnit i HIT – T15-insulinomceller transfekterade med GLP-1-receptorn som GLP – 1 orsakar en ökning av spänningsberoende Ca2 + – strömmar (se 56 och Fig. 3A). Detta beror åtminstone delvis på ett vänsterskifte i spänningsberoendet av aktivering som påminner om effekten av vdcc-fosforylering genom PKA (57,58)., Vi observerade också ett högerskifte i spänningsberoendet av steady-state inaktivering så att i närvaro av GLP-1 var mindre kanaler effektivt inaktiverade vid en given hållpotential (50). Detta stöds av Britsch et al. (50), som föreslår att GLP-1 Behandling av mus β-celler saktar inaktivering av spänningsberoende Ca2+ strömmar. Dessutom ledde GLP-1 till en ökning av intracellulärt kalcium först efter glukostillsats, en effekt som delvis blockerades av VDCC-antagonister (Fig. 3C)., Förmågan hos GLP-1 att förbättra Ca2 + strömmar är, liksom effekten på KATP kanaler, cAMP beroende (51,52), baserat på förmågan hos Rp-läger för att förhindra en ökning av strömmar. Verkligen, behandling av råtta β-celler med dibutyryl cykliska AMP -, membran-genomsläpplig cAMP analog, replikerade effekten av GLP-1 på Ca2+ strömmar (51)., Dessutom, i våra studier (56), den VDCC svar till GLP-1 förlorade i HIT-T15 celler som uttrycker en mutant GLP-1-receptorn som saknar kritisk rester som krävs för koppling till adenylyl cyklas, medan VDCC aktivitet kan fortfarande bli bättre av lägret oberoende agonist BAYK8644. Den senaste tyder på att En a-kinas förankring protein (AKAP), AKAP18, mål PKA till VDCCs och att detta kinas kan vara inblandade i GLP-1 modulering av dessa kanaler (59).,
förutom effekter på Vdcc kan GLP-1 mobilisera intracellulära kalciumbutiker på ett cAMP-beroende sätt (60,61), vilket eventuellt bidrar till det oscillerande i-svaret på GLP-1 som ses i HIT-T15-celler (Fig. 3C) (62). Våra studier tyder på att GLP-1 ansökan leder till svängningar i jag i HIT-T15 celler och att dessa svängningar är inte avskaffas (även om de minskar i amplitud) genom borttagning av extracellulära Ca2+, eller genom att VDCC blockad (Fig. 3C)., I ett antal celltyper orsakas Ca2+ – oscillationer inducerade av en agonist primärt av Ca2 + – frisättning genom inositoltrisfosfat (IP3) och/eller ryanodinkänsliga butiker (63-65). I β-celler mobiliserar GLP-1 Ca2 + – butiker i stor utsträckning genom att sensibilisera ryanodinreceptorn (sannolikt typen 2 isoform, RYR-2) till processen med Ca2+-inducerad Ca2+ – frisättning (CICR) (61,66). Flera studier har visat att GLP – 1 kan öka i på ett PKA-oberoende sätt (67-69)., Denna mekanism har nyligen tillskrivits CICR från ryanodine-känsliga butiker via cAMP-reglerade guanin nukleotid utbyte faktor II (GEF-II eller Epac2) och dess samspel med antingen Ras-relaterade liten G-protein Rap1 eller med Rab3 liten G-protein effektor Rim2 (68). Betydelsen av cAMP-GEF-II-Rim2 har visats, eftersom inaktivering av detta komplex (genom antisense oligonukleotider eller mutantkonstruktioner) försvagade det sekretoriska svaret hos musöar eller min6-insulinomceller till GLP-1 (67)., Eftersom Camps affinitet för PKA är mycket högre (100 nmol / l) jämfört med cAMP-GEF-II (10 mmol/L), är det intressant att spekulera om att GLP-1-stimulerad cAMP-GEF-II-vägen kan fungera på en ökning av lokalt läger snarare än globala förändringar., Även om GLP-1-receptorsignalering stimulerar IP3-produktion i GLP-1-receptor-Uttryckande COS-celler (70), är en roll för IP3-känslig Ca2+-butiker i global i tvivel eftersom GLP-1-stimulerad IP3-produktion i primära β-celler är enligt uppgift minimal (71,72) och IP3-receptorantagonisten xestospongin C misslyckades med att blockera frisättning av intracellulär Ca2+ – butiker genom forskolin-behandling (68). IP3-reglerad Ca2 + – frisättning från insulingranuler har dock föreslagits av studierna av Nakagaki et al., (62), som föreslår att GLP-1 kan unikt reglera tidsmässig och rumslig frisättning av intracellulärt kalcium genom lokal IP3-signalering. Således bidrar GLP-1-medierad frisättning av intracellulära butiker, tillsammans med potentiering av Ca2+-inträde genom VDCCs, sannolikt till den insulinotropa effekten av GLP-1.
GLP-1 Och β-cell kV-kanaler.
spänningsberoende k+-strömmar, såsom de som medieras av kv-eller KCa-kanaler, förmedlar repolarisering av β-celler efter en depolariserande stimulans, såsom glukos (37)., Nyligen rapporterade vi att Kv1 och Kv2 familjekanaler reglerar insulinsekretion, eftersom dominerande negativ funktionell knockout av någon av dessa kanalfamiljer förbättrade GSIS (73). Kv2. 1-kanaler förmedlar majoriteten av denna effekt (>60%), vars mekanism innefattar förbättrad glukosstimulerad membrandepolarisering och Ca2+-inträde (opublicerade observationer). Eftersom β-cell kV-strömmar är potenta glukosberoende regulatorer av insulinsekretion, antar vi att fysiologiska sekretagogi, såsom GLP-1, kan reglera kV-kanalfunktionen., Faktum är att vi rapporterar någon annanstans i detta tillägg att GLP-1-receptoragonisten exendin 4 hämmar spänningsberoende utåt k + – strömmar i råtta β-celler spänningsklämd i hela cellkonfigurationen med 40% och förlänger signifikant tidsförloppet för β-cellrepolarisering efter övergående depolarisering genom ströminjektion. Detta kan jämföras med en minskning på 86% av de yttre k+ – strömmar som uppnås med den allmänna kV-kanalantagonisten tetraetylammonium. GLP-1 antagoniserad spänningsberoende utåt k + strömmar i råtta β-celler i frånvaro av glukos., Denna effekt kan emellertid fortfarande bidra till glukosberoende av GLP-1s insulinotropa effekt, eftersom kV-kanaler normalt inte förväntas vara aktiva förrän efter en glukosinducerad depolarisering av cellmembranet (37). Dessutom, och liknande effekten av GLP-1 på de andra jonkanaler som nämns ovan, är exendin 4-medierad hämning av β-cell kV-kanaler beroende av cAMP-signalering. En ny studie föreslog emellertid att cAMP-signalering inte var tillräcklig i sig för att motverka spänningsberoende k + – strömmar i en insulinsekreterande celllinje (ins-1) (74).,
många studier har beskrivit effekter av hormonmedierade förändringar i spänningsberoende k+-strömmar, både excitatoriska och hämmande. Den bäst karaktäriserade av dessa effekter är den spänningsberoende k + nuvarande nedreguleringen i lymfocyter och uppreglering i hjärtmyocyter (75,76). I båda dessa vävnader har cAMP/PKA-signaleringsvägen varit inblandad i regleringen av dessa kanaler (76,77)., Rapporter tyder på att cAMP kan minska spänningsberoende k + strömmar i murina lymfocyter (76) och en hypofyscellslinje (78) men förbättra spänningsberoende k+ strömmar i hjärtmyocyter (77), ett konstaterande som har bekräftats på enkanalsnivå i groda atriella myocyter (79) och jätte squid axon (80)., Fosforylering kan ske direkt på kanalen, eftersom PKA-fosforylering av en atriell Kv-kanal nära NH2-terminusförstärkt kanalaktivitet (81) och fosforylering av Kv1-kanal α-subenheter reglerar graden av inhibering av dessa kanaler som ges av en reglerande β-subenhet (82). Fosforylering av β-subenheter själva kan också modulera den regulatoriska interaktionen med porbildande α-subenheter (83). Det har nyligen visats att reglering av en hjärtkv-kanal (KvLQT) av cAMP kräver uttryck av AKAP15/18 eller AKAP79 (84)., Dessutom är en ökning av spänningsberoende k+-ström inblandad i epinefrin-inducerad hämning av den glukosberoende ökningen av i i ob/ob och +/+ mus β-celler (85) eftersom effekten reverserades av tetraetylammonium. Intressant var den hämmande effekten av epinefrin på i också omvänd av adenylylyklasaktivatorn forskolin (85). Därför tror vi att det finns monteringsbevis som tyder på att hormonell modulering av kv-strömmar är fysiologiskt viktigt. Specifikt förväntas GLP – 1-hämning av dessa strömmar leda till ökad β-cell excitabilitet.,
GLP-1 och andra β-cell jonkanaler.
ökningar i intracellulärt läger har länge varit kända för att förbättra na + – strömmar (86), en effekt som kan förmedlas genom direkt kanalfosforylering med PKA (87). En övergående na + nuvarande svar på cAMP beskrevs först i gastropod neuroner och kallas ina(cAMP) (88)., I insulin-utsöndrande celler har RNA-uttryck av icke-selektiva katjongener mSTRPC4 och LTRPC2 nyligen detekterats i insulinomceller respektive humana öar (89) och cAMP har rapporterats inducera genuttrycket av mNSC1, som kodar för en icke-specifik katjonkanal (NSCC) (90). GLP-1 är tänkt att förbättra en NSCC bär övervägande Na + strömmar (91,92). Denna effekt uppstår genom GLP-1s aktivering av cAMP-signalering och frisättning av intracellulära Ca2+-butiker och kan fungera som ännu en viktig modulatorisk väg för GLP-1 i β-cellen (40)., Det är inte klart om de NSCCs som aktiveras av GLP-1 motsvarar den icke-selektiva katjonströmmen som produceras genom aktivering av Ca2 + – sensingreceptorn (93), men den senare effekten rapporteras inte innebära aktivering av GS-subenheten och kan därför inte involvera cAMP/PKA-banan.
det är föga känt om effekterna av GLP-1 på andra jonkanaler. Cellsvullnad-aktiverade CL-strömmar har detekterats i insulin-utsöndrande celler (94), men en roll för dessa kanaler i insulinsekretion är oklart., Cl-kanaler såsom cystisk fibros transmembrane conductance regulator och utåt rektifierande CL− kanaler aktiveras av cAMP / PKA signalering (95). Om det förekommer i β-cellen, skulle denna effekt tenderar att främja depolarisering. En rapport tyder på att GLP-1 aktiverar en Ca2+− känslig CL-ström i Xenopus oocyter som uttrycker GLP-1-receptorn (96), en effekt som var beroende av Ins(1,4,5)P3-beroende intracellulär Ca2 + mobilisering (96). Det återstår dock att bestämma om GLP – 1 kan stimulera CL-strömmar i insulin-utsöndrande celler.
GLP-1 och exocytos.,
glukos kan utöva en stimulerande effekt på insulin exocytos, oberoende av dess väl karakteriserade åtgärder initierade av hämning av KATP-kanaler. Betydelsen av denna väg kan delvis realiseras av det faktum att möss med en riktad störning i KATP (Kir 6.2 eller SUR1) inte visar uppenbara abnormiteter i glukostolerans (97,98). KATP-oberoende insulinsekretion är inte väl förstådd och tros involvera flera signaler som verkar på nonjoniska mål, särskilt de distala stegen av exocytos., Det har föreslagits att glukosmetabolism krävs för denna stimulerande effekt och att troliga signaler inkluderar ATP, cAMP, glutamat och malonyl-CoA (rev.i 99 och 100). Med tanke på att ATP, cAMP och PKA alla är inblandade i den exocytotiska processen är det rimligt att tro att GLP-1 kan ha effekter distala för åtgärder på jonkanaler, vilket ytterligare förstärker insulinsekretionen. Det är välkänt att åtgärder som undertrycker GLP-1-inducerad cAMP-ackumulering och PKA-aktivering hämmar insulinsekretion, vilket tyder på att cAMP och/eller PKA är de troliga effektorerna (101)., I mus β-celler kan endast en bråkdel av exocytos redovisas genom åtgärder på stimulanssekretionskoppling (102). Från studier som visar att cAMP inducerar utsöndring i närvaro av låg och hög i, föreslås det att cAMP sensibiliserar exocytotiska maskiner. Studier med fotoreleasable cAMP och PKA-hämmare visar att cAMP framkallar PKA-beroende och oberoende effekter på exocytos. Ökningar i cAMP, oberoende av PKA-aktivering, verkar påskynda exocytos av den lätt släppbara poolen i β-celler (103)., PKA-beroende mobilisering av sekretoriska granuler, till skillnad från generering av cAMP själv, verkar kräva glukosmetabolism (ökad ATP / ADP) och innefattar translokation av granuler (103,104). En sådan effekt skulle öka storleken på den lätt släppbara poolen, öka graden av påfyllning av poolen och förbättra exocytos. Eftersom GLP – 1 kan öka både cAMP och PKA, kan effekter på exocytos underförstås från dessa data., Det finns flera potentiella målproteiner för verkan av GLP-1, inklusive β-celllösliga n-etylmaleimidkänsliga faktorfästproteinreceptorer (SNARE) proteiner (105).
GLP-1 och intracellulär energi homeostas.
nyligen genomförda studier på klonala β-celler tyder på att de insulinotropa effekterna av GLP-1 delvis medieras av en PKA-beroende stimulering av hormonkänsligt lipas (HSL) (106). Det föreslås att lipolytiska åtgärder av GLP-1 orsakar nedbrytningen av trigycerider till fria fettsyror i β-celler, vilka sedan omvandlas till långkedjig CoA., En ökning av fria fettsyror kan sedan ge substrat för mitokondriell oxidation och ATP-produktion, vilket leder till en större ökning av det intracellulära ATP-till-ADP-förhållandet och ytterligare inhibering av KATP-kanaler. Dessutom, eftersom ATP själv kan påverka exocytos, kan några av GLP-1-åtgärderna vara att rikta in sig på exocytosens distala steg, som nämnts ovan. Det har visats i flera studier att ATP markant underlättar exocytos oberoende av cellulär depolarisering men är beroende av Ca2 + (99)., Således kan ännu en potentiell mekanism förklara GLP-1-inducerad insulinsekretion.