detektion av Pneumocystis jiroveci i respiratoriska prover med fyra färgningsmetoder

Pneumocystis jiroveci, tidigare känd som Pneumocystis carinii, är fortfarande en viktig orsak till lunginflammation hos patienter med nedsatt immunförsvar, även om infektioner med detta medel har minskat efter att den utbredda användningen av högaktiv antiretroviral terapi (HAART) för humant immunbristvirus (HIV) – infektion (9, 12). Patienter som är immunkompromiserade av andra skäl än HIV-infektion löper också risk för lunginflammation orsakad av P., jiroveci, inklusive patienter med hematologiska maligniteter och de som har fått immunosuppressiva medel för behandling av autoimmuna sjukdomar (2, 11, 12).

även om en mängd olika amplifieringsanalyser av nukleinsyra, inklusive PCR-analyser i realtid, har utvecklats för detektion av P. jiroveci, är dessa analyser inte vanliga i de flesta kliniska mikrobiologiska laboratorier och är inte tillgängliga kommersiellt (3, 5). Därför är den huvudsakliga laboratoriemetoden för detektering av P., jiroveci, en organism som inte kan odlas med standardmetoder, är den direkta visuella undersökningen av det kliniska provet efter någon typ av färgningsmetod (12). En mängd histokemiska fläckar har använts för att detektera Pneumocystis i kliniska prover. Dessa histochemical fläckar inkluderar Diff-Quik, Grocott-Gomori methenamine silver (GMS), och Calcofluor vita fläckar. Diff-Quik fläcken är en modifiering av Wright fläcken (3). GMS stain är en silver nederbörd fläck som vanligen används för att visualisera svampar i histologiska sektioner (10)., Calcofluor vit fläck är en fluorescerande fläck, vars aktiva beståndsdel är cellufluor, som ospecificerat binder till beta-kopplade polysackarider, såsom kitin och cellulosa, och används för direkt visualisering av svampar i kliniska prover (4). Immunofluorescerande fläckar, som använder antikroppar riktade mot P. jiroveci, är också tillgängliga för direkt detektering av denna organism i kliniska prover (3, 5). Dessa fläckar liknar de direkta och indirekta immunofluorescerande fläckar som används för detektering av virus i kliniska prover., Varje fläck har sina förespråkare; jämförande data i HAART-eran är begränsade.

därför utförde vi en flerinstitutionell bedömning av fyra vanliga färgningsmetoder för direkt detektering av P. jiroveci i kliniska respiratoriska prover. Bilderna från respiratoriska prover som studerades, varav de flesta var bronchoalveolära lavageprover, framställdes med användning av cytocentrifugation. Kopiera utstryk av 313 respiratoriska prover som lämnats in för P. jiroveci undersökning undersöks för förekomsten av P. jiroveci med Calcofluor vit (Fungifluor; Polysciences, Inc., Warington, Pappa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Vetenskapliga, McGraw Park, Ill.), och Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc. Cincinnati, Ohio) fläckar. Bilder var målat med Merifluor Pneumocystis och Diff-Quik fläckar enligt tillverkarens instruktioner. För Vitfärgning av Kalkofluor tillsattes 1 droppe Fungifluor till varje glid, täckglaset applicerades så att reagenset täckte hela det preparathaltiga området och gliden fick sitta i minst 10 min i en mörk fuktighetskammare vid rumstemperatur före Tolkning med ett fluorescensmikroskop., För GMS-färgning mikrovågades glidbanorna i 40 s i en 10% kromsyralösning, tvättades med vatten och rensades sedan med 1% natriummetabisulfit i 30 s. efter att glidbanorna tvättades med destillerat vatten placerades de i en Koklinburk innehållande 50,0 ml metenaminarbetslösning och mikrovågade i ytterligare 65 s., Bilderna sköljdes igen med destillerat vatten, behandlat med 1% guldklorid för 2 till 5 s, sköljdes med destillerat vatten, utsatt för 5% natriumtiosulfat i 1 min, motverkad med en ljusgrön arbetslösning, rensad i xylen, täckt med täckglas och undersöktes genom rutinmässig ljusmikroskopi.

var och en av laboratorierna från de fyra deltagande institutionerna utförde en av de olika fläckarna och gjorde sina tolkningar baserade på den färgningsmetoden., Individerna vid varje institution hade erfarenhet av färgningsmetoden som utfördes där och tolkningen av fläcken. Proverna fick unika identifieringskoder, och varje fläck undersöktes oberoende, utan kunskap om resultatet som erhållits genom en annan färgningsmetod på samma prov., Mängden prov var sällan otillräcklig för att göra alla fyra glidbanor; 308 glidbanor var tillgängliga för färgning med Calcofluorvit, 310 glidbanor var tillgängliga för färgning med Merifluor Pneumocystis, 307 glidbanor var tillgängliga för färgning med Diff-Quik och 310 glidbanor var tillgängliga för färgning med GMS. I inget av de fall där en bild inte var tillgänglig på grund av en otillräcklig mängd prov gjorde kategoriseringen av det provet som en sann positiv eller sann negativ (se nedan) beroende av resultatet av den frånvarande bilden.,

känsligheten, specificiteten och positiva och negativa prediktiva värden beräknades med standardmetoder (Tabell 1). Andelen sant positiva och falskt positiva resultat för parade tester jämfördes med chi-square test med EpiCalc 2000 statistisk programvara (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Även om mer sant positiva prover upptäcktes av Merifluor Pneumocystis fläcken, detta var inte signifikant från dem som upptäcks av Calcofluor vit (P = 0.260) och GMS (P = 0.343) fläckar., På samma sätt var antalet sanna positiva detekterade av GMS och Kalkofluor vita fläckar inte signifikant olika (P = 0.838) från varandra. Antalet verkliga positiva fynd av Diff-Quik-fläck var emellertid signifikant färre än de som detekterades av Merifluorpneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027) och Kalkofluorvita (p = 0,042) fläckar. Antalet falska positiva var inte signifikant olika mellan Kalkofluorvita, GMS och Diff-Quikfläckarna (varje jämförelse hade ett p-värde på >0,05)., Antalet falska positiva rapporterade efter färgning med Merifluor Pneumocystis fläck var emellertid signifikant större än de som rapporterades efter färgning med GMS (P = 0.004), Kalkofluorvit (p = 0.001) eller Diff-Quik (P = 0.001).

i vissa fall kan ett inducerat sputumprov vara det första prov som tagits för bedömning av förekomst av Pneumocystis i diagnosarbetet hos en patient med lunginflammation som misstänks orsakas av denna organism (6)., Om ett inducerat sputumprov inte ger det etiologiska medlet av lunginflammation, kan ett prov från bronchoalveolär lavage, som är betydligt dyrare och bär en liten risk för patienten, behövas för att erhålla diagnostiskt material., På grund av skillnaderna i behandling av lunginflammation orsakad av Pneumocystis kontra lunginflammation orsakad av andra mikroorganismer och det möjliga behovet av bronkoskopi, som medför extra kostnad och risk för patienten, i händelse av att en diagnos inte är etablerad, är det viktigt att den bästa möjliga färgningsmetoden används för detektering av denna organism.,

dessutom är betydelsen av en känslig och specifik färgningsmetod i HAART-eran särskilt viktig, eftersom den lägre förekomsten av lunginflammation orsakad av Pneumocystis påverkar det positiva prediktiva värdet av varje analys som har en specificitet mindre än 100% (9). Även om förekomsten av lunginflammation orsakad av Pneumocystis är annorlunda i HAART-eran än i pre-HAART-eran, är valet av den optimala färgningsmetoden för detektering av Pneumocystis också viktigt för patienter med andra immunkompromiserande tillstånd som löper risk för infektion., I själva verket kan valet av den optimala färgningsmetoden vara viktigare för detektering av Pneumocystis hos icke-HIV-infekterade, immunkompromiserade patienter, eftersom det har visat sig att andningsprover från dessa patienter har en lägre belastning av organismer än de från HIV-infekterade, immunkompromiserade patienter (6).

enligt vår erfarenhet var Diff-Quik-fläcken inte ett effektivt sätt att screening för närvaron av P. jiroveci (dvs en primärfärgningsmetod) på grund av det låga känsligheten och negativa prediktiva värdet av denna fläck. Betydligt fler exemplar som innehöll P., jiroveci missades av Diff-Quik metod än med Calcofluor vit, Merifluor Pneumocystis, och GMS. Raab et al. beskriv också både en låg känslighet (68%) och en låg specificitet (88%) när diff-Quik-fläcken ensam användes för detektering av Pneumocystis och andra svampar i bronchoalveolära lavageprover (10). Dessa fynd är emellertid i motsats till andra gruppers, som har rapporterat att Diff-Quik-metoden var jämförbar med GMS-färgningsmetoden för detektering av Pneumocystis (7, 8)., En grupp rapporterade att Diff-Quik-metoden var känsligare än Kalcofluorvit, direkt immunofluorescerande färgning och till och med PCR, men dessa resultat har inte bekräftats (1).

omvänt var Merifluor Pneumocystis-fläcken den mest känsliga färgningsmetoden och kan vara användbar som en skärm för att utesluta förekomsten av Pneumocystis, men det var den minst specifika metoden i denna studie. Antalet falskt positiva resultat med Merifluor Pneumocystis-fläcken var emellertid signifikant större än det som rapporterades för var och en av de andra fläckarna., Merifluor Pneumocystis fläcken hade ett positivt prediktivt värde på endast 81,9%, jämfört med de andra tre metoderna, som alla hade positiva prediktiva värden större än 96%. Ng et al. har också beskrivit skenbara falskt positiva resultat med denna färgningsmetod (8). Därför föreslår vi att om Merifluor Pneumocystis används som primärfärgningsmetod i ett kliniskt mikrobiologilaboratorium, bör bekräftelse med en andra metod utföras för att öka specificiteten och det positiva prediktiva värdet av det slutliga testresultatet.,

känslighet för både Calcofluor vit och GMS fläckar som är ett mellanting mellan de Diff-Quik och Merifluor Pneumocystis fläckar, men de var mycket specifika och positiva prediktiva värden över 96% och negativa prediktiva värden över 93%. Fraire et al. har också beskrivit Calcofluor vita och GMS fläckar som jämförbara för detektering av Pneumocystis, med 92,6% concordance (4). Baughman et al., (1a) beskriver också känsligheten hos en indirekt immunofluorescerande antikroppsfläck som riktas mot Pneumocystis och överlägsen känslighet jämfört med en modifierad Wright-fläck och en GMS-fläck, men de rapporterade om ett enda falskt positivt resultat och därför en mycket högre specificitet än vi beskriver. Det är möjligt att med ytterligare övning kan man lättare känna igen de patognomoniska formerna med Diff-Quik-fläcken och därigenom höja känsligheten hos den analysen., På samma sätt, kanske med ytterligare erfarenhet av Merifluor Pneumocystis-fläcken, kan man lära sig att bättre diskriminera mellan sann-positiv och falsk-positiv färgning och därigenom minska antalet falskt positiva resultat.

enligt vår erfarenhet har Calcofluor-vita och GMS-fläckar de bästa parametrarna för rutinanvändning i ett kliniskt laboratorium. Även om dessa analyser var mindre känsliga än immunofluorescerande analysen var de mycket specifika och hade mer än acceptabla positiva och negativa prediktiva värden.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology