cellinjer
HEK 293T cell linjen var som erhållits från American Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Musen hybridom cellinjer KT13 och KT22 erhölls från Utvecklings Studier Hybridom Bank (DSHB). Både cell-linjer förvarades till DSHB av Kazumasa Takeda och Asako Sugimoto (DSHB hybridom produkter KT13 och KT22)., Musen hybridom cell linje 5E4/1F1 var vänligt av Miha Kosmač och Vladka Čurin Šerbec (Universitetet i Ljubljana). HEK 293T och hybridom cellerna odlades i DMEM (Gibco) kompletteras med 13% FBS (Gibco), 1× Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher), och 1× GlutaMAX (Gibco). ANTIKROPPSHC och LC-sekvenser från enskilda hybridomas bestämdes genom omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) och kapillärsekvensering (Eurofins genomik).,
Cykloheximidbehandling och mikrosomberedning
alla pipettningssteg utfördes på is och centrifugeringar utfördes vid 4 °C med användning av en Eppendorf 5810R centrifug med fast vinkelrotor F-45-30-11. – herr talman! Protein LoBind 1.5 mL centrifugrör (Eppendorf) användes för att minimera celladhesion mot rörväggarna. HEK 293T-celler (1 miljon), mus hybridoma-celler (1 miljon av 5E4, KT13 och KT22-celler blandade i förhållande 1:1:1), ARH-77 leukemiceller (ATCC CRL-1621, 1 miljon) eller nyligen isolerade humana CD19 + B-celler från pre-och post Td-booster immuniseringsprover (1.,5 miljoner vardera) resuspenderades i 1 mL PBS med 50 µg/mL cykloheximid och inkuberades i 10 min till stall ribosomer med tillhörande budbärare RNAs (mRNA) vid den grova endoplasmatiska retikulum. Cellerna var pelleterat med 300 g i 10 min vid 4 °C och modellberäknad återgrumling av pipettering 15× upp och ner i 120 µL hög densitet lyseringsbuffert (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM kalium-acetat, 5 mM magnesium-acetat, 1 mM EGTA, 25% sackaros , 5% glycerol, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× komplett EDTA-gratis proteashämmare cocktail , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitonin, och 400 U/mL RiboLock RNase-hämmare )., Cell och organell lysis slutfördes genom inkubation för 10 min på is. Varje homogenat delades upp i två 55 µL alikvot och överfördes till två färska Proteinlobindrör. Rören centrifugerades vid 600 g under 3 min vid 4 ° C till pellets kärnor och cellrester. Totalt 40 µL supernatant från varje rör, innehållande membranfraktioner och cytosol, överfördes till färska Proteinlobindrör och sackaroskoncentrationen späddes till 0,37-0,40 m (12-13% w / w) genom tillsats av 40 µL nukleasfritt vatten. Mikrosomer sedimenterades sedan genom centrifugering med 20 800 g under 120 min vid 4 ° C., De cytosolhaltiga supernatanterna kasserades och membranpellets resuspenderades genom pipettering 10× upp och ner i 85 µL tvättbuffert (25 mM HEPES-KOH pH 7.2, 110 mM kaliumacetat, 2.5 mM magnesiumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-ditiotreitol, 1× komplett EDTA-fri proteashämmare cocktail, 0.1 mg / mL cykloheximid, 0.004% digitonin och 400 U / ml RiboLock rnashämmare). Mikrosomerna sedimenterades igen genom centrifugering med 20 800 g under 60 min vid 4 ° C., Supernatanter kasserades och mikrosompellets återsuspenderades i 20 µL tvättbuffert och hölls på is tills vidare användning.
transmissionselektronmikroskopi
Prova alikvoter av 3,5 µL av återgrumlat HEK 293T microsomes användes för att fräscha lyster ut Quantifoil nät (Quantifoil, Tyskland) täckt med en ytterligare 2 nm kol stöd för film och flash-fryses i flytande etan med hjälp av en Vitrobot kolven (FEI). Proverna avbildades på ett Tecnai Spirit transmission electron microscope (FEI) som drivs vid 120 kV utrustad med en 2 × 2 K Eagle CCD-kamera (FEI)., Mikrografer registrerades under cryo lågdosförhållanden vid 42,000× nominell förstoring (pixelstorlek vid objektskala: 5.2 Å/px) med en defokus på − 2 till − 4 µm. Datainsamlingen utfördes antingen manuellt eller helt automatiskt med hjälp av Leginon .
Emulsion RT-PCR-enhet med mus hybridom mikrosomer
vi spädde 16 µL återsuspenderade mikrosomer från blandade hybridomas 5E4, KT13 och KT22 i 184 µL RT-PCR master mix innehållande 1× Verso 1-Steg RT-PCR master mix (Thermo Scientific), 1× Verso enzyme mix (Thermo Scientific), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide, och primers för omvänd transkription och HC och LC församling (0.8 µM av varje primer TitA_MID1_IgM_rev och TitB_MID12_IgK_rev; med 0,16 µM av varje primer OE_MHV_fwd och OE_MKV_fwd). Primersekvenser visas i ytterligare fil 1: figur S1a. den resulterande 200 µL vattenlösning användes för att bilda en vatten-i-oljeemulsion genom droppvis tillsats (13 alikvoter av 15 µL i 30-s intervall) till 800 µL oljefas enligt Ge et al. (Mineralolja, Sigma M5904 med 4,5 procent Span 80, Sigma S6760, 0.4% Tween 80, Sigma P8074, och 0.,05% Triton X-100, Sigma T8787) under kontinuerlig omrörning på en magnetisk omrörare., Sex alikvot på 100 µL var och en av den resulterande emulsionen överfördes till PCR-rör och utsattes för termo med följande betingelser: omvänd transkription vid 50 °C under 15 min, rtasinaktivering vid 95 °C under 2 min, därefter fyra denatureringscykler vid 95 °C under 20 S, glödgning rampdown från 60 °C till 50 °C under 50 s och förlängning vid 72 °C under 1 min, därefter 16 denatureringscykler vid 95 °C under 20 s, glödgning vid 60 °C under 30 s och förlängning vid 72 °C under 1 min, följt av ett slutförlängningssteg vid 72 °C under 5 min., Parallellt utfördes en öppen RT-PCR-kontroll genom utspädning av 4 µL resuspenderade mikrosomer i 46 µL RT-PCR-masterblandning och termocykling av reaktionen parallellt med emulsionen RT-PCR. PCR-montering produkter ur emulsion med isobutanol (2-Metyl-1-propanol, Sigma) och Zymo DNA Rena & Koncentrator-5 kit (Zymo Research) som tidigare publicerats . Det resulterande DNA och PCR-produkten från den öppna PCR-kontrollen laddades på en 1.2% TBE-agarosgel och separerades med 90 V i 60 min., Monteringsprodukter av 800-950 bp-storlek var Storlek-utvalda från agarosgelen och produkterna återhämtades med hjälp av ett Zymoclean Gel DNA Recovery kit. Monteringsprodukter eluerades i 6 mM Tris-cl pH 8 och lagrades vid-20 °C tills vidare analys.,
Nested PCR-amplifiering av musen hybridom montering produkter
Efter emulsion montering reaktion, montering produkter har ytterligare förstärkt med adapter primers TitA_fwd, 5′ CGT ATC-GCC TCC CTC modell nr: gcg CCA TCA G 3″, och TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA G 3′, med Phusion hifi-DNA-polymeras kit (Finnzymes) med följande termocykling villkor: för det Första denaturering vid 98 °C i 30 s, sedan 15 cykler av denaturering vid 98 °C efter 7 s och glödgning/förlängning vid 72 °C i 30 sekunder, följt av en sista förlängning steg vid 72 °C i 5 min., PCR-produkterna har renats med Zymo DNA Rena & Koncentrator-5 kit. Parningen av HC och LC i monteringsprodukterna analyserades sedan av PCR med kapslade primrar som är specifika för de tre olika HC och tre olika LC (ytterligare fil 1: figur S1e) med hjälp av Phusion high-fidelity DNA polymerase kit med följande termocykelförhållanden: initial denaturering vid 98 °C för 30 s, sedan 24 cykler av denaturering vid 98 °C för 7 s och glödgning/förlängning vid 72 °C för 30 s, följt av ett slutförlängningssteg vid 72 °C för 5 min., Kapslade PCR-produkter laddades på en 1.2% TBE-agarose gel och separerades med 90 V för 40 min. Realtid nested PCR för kvantifiering av korskontaminering genomfördes i triplicates med samma kapslade primers med SYBRGreen master mix (Applied Biosystems) på en StepOne qPCR cykler (Applied Biosystems) med följande termocykling villkor: för det första denaturering vid 95 °C under 10 min, följt av 40 cykler av denaturering vid 95 °C i 15 s, glödgning vid 56 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C i 45 s., De initiala överflödarna av de förstärkta monteringsprodukterna beräknades med hjälp av 2^(-deltaCt) – metoden och ritades som stapeldiagram med felstavar som visar standardavvikelse från medelvärdet.
immunisering och isolering av CD19+ B-celler från perifera helblodprover
de humana perifera helblodprover som användes i denna studie erhölls från in.vent Diagnostica GmbH som biprodukter från rutinmässiga diagnostiska förfaranden. i.,vent Diagnostica GmbH har skriftligt informerat samtycke från givaren att använda av-produkter för forskning och har ett etiskt godkännande från Freiburg Etik Kommissionen International (FEKI kod 011/1763) för fördelning av prover. En hälsosam proband genomgick boosterimmunisering med tetanustoxoid (TT)/Dipteritoxoid (dt) (Td-pur®; 20 internationella enheter TT och 2 IE DT; Novartis, Basel, Schweiz)., K2-EDTA perifert helblod härrörande från förimmunisering (dag 0) och sju dagar efter TD booster immunisering användes för att isolera CD19+ B-celler med hjälp av CD19 pluriBead Cell Separation Kit (pluriSelect GmbH, Leipzig, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Isolerade CD19 + B-cellpellets tvättades i 1 mL kalla PBS och centrifugerades vid 300 g i 10 min vid 4 ° C. Cellpellets motsvarande 1,5 miljoner B-celler från både pre-och post-immuniseringsprover hölls på is tills cykloheximidbehandling och mikrosomberedning.,
Emulsion RT-PCR-enhet med användning av humana B – cellmikrosomer
vi tillsatte 2 µL utspädda mikrosomer framställda från frysta ARH-77-celler (som intern parningskontroll) till 26 µL återsuspenderade mikrosomer från B-celler både före och efter Td-immunisering, så att den slutliga fraktionen av ARH-77-mikrosomer är 0,5% (v / v). Vi spädde 16 µL av denna mikrosomer suspension i 184 µL RT-PCR master mix innehållande 1× dART 1-steg RT-PCR master buffer mix (Roboklon), 2× dART master enzyme mix (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cykloheximid och primrar för omvänd transkription (IgM, IgG och IgK) och tung (VH) och lätt kedja (VK) montering. Primersekvenser och koncentrationer i RT-PCR master mix anges i ytterligare fil 1: Tabell s2., Den resulterande 200 µL vattenlösning användes för att bilda en vatten-i-oljeemulsion genom droppvis tillsats (13 alikvoter av 15 µL i 30 s intervall) till 800 µL oljefas bestående av 73% emulsionskomponent 1, 7% emulsionskomponent 2 och 20% emulsionskomponent 3 i MICELLULA DNA emulsion och reningssats (Roboklon) under kontinuerlig omrörning på en magnetisk omrörare., Sex alikvot på 100 µL var och en av den resulterande emulsionen överfördes till PCR-rör och utsattes för termo med följande betingelser: omvänd transkription vid 55 °C i 30 min, initial denaturering vid 95 °C i 3 min, därefter tre denatureringscykler vid 95 °C i 20 s, glödgning vid 56 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C i 2 min, därefter 20 denatureringscykler vid 95 °C i 20 s, glödgning vid 56 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C i 4 min, följt av en slutförlängningssteg vid 72 °C i 5 min., PCR-montering produkter ur emulsion med isobutanol (2-Metyl-1-propanol, Sigma) och Zymo DNA Rena & Koncentrator-5 kit (Zymo Research) som tidigare publicerats . De resulterande DNAs laddades på en 1% TBE-agarosgel och separerades med 100 V i 45 min. Monteringsprodukter av 700-800 bp var Storlek-utvalda från agarosgelen, återhämtade sig med hjälp av ett Zymoclean Gel DNA Recovery kit, eluerat i 6 mM Tris-cl pH 8 och lagrade vid-20 °C tills vidare analys.,
kapslad PCR-förstärkning av humana B-cellmonteringsprodukter
för specifik ytterligare förstärkning av HC-LC-monteringsprodukterna utfördes en kapslad PCR-förstärkning med kapslade primrar som är specifika för IgM -, IgG-och IGK-konstanta regioner (ytterligare fil 1: Tabell S2). PCR-reaktionen innehöll kapslade primrar vid 0,4 µM koncentrationer, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reaktionsbuffert och 0,02 U / µL Q5 high-fidelity DNA polymeras (New England Biolabs) i en reaktionsvolym på 50 µL med 3 µL sammansatt DNA., Kapslade PCR amplifiering utfördes med följande termo förhållanden: initial denaturering vid 98 ° C under 3 min, sedan 34 cykler av denaturering vid 98 ° C för 30 s och glödgning/förlängning vid 71 °C under 1 min, följt av en slutlig förlängning steg vid 72 °C under 5 min. Prover samlades in efter tre olika PCR-cykelnummer (28, 31 och 34 cykler). Förstärkta PCR-produkter laddades på 1% TBE-agarosgeler och separerades med 100 V i 60 min., De önskade produkterna av ~ 710 bp extraherades som beskrivits ovan, sekvenseringsbiblioteken framställdes efter Illumina TruSeq DNA – provberedningsguiden och 2 × 250-basparade slutläsningar sekvenserades med Illumina MiSeq-plattformen.
bioinformatisk analys av parade antikroppar tunga och lätta kedja repertoarer
Demultiplexing av 2 × 250 bas Parade-end läser från MiSeq sekvenseringsplattform utfördes baserat på adapterindex och sekvenseringsdata erhölls i fastq-format., Endast läser med minsta Phred kvalitetspoäng på 10 över 50% av alla nukleotider behölls och skannas för IgM, IgG och IgK constant region sekvenser. Läs paren saknar konstant regionen sekvenser eller visar HC-HC eller LC-LC struktur filtrerades bort och de återstående läser omvandlades till fastq-format och används som underlag för analys med MiXCR (v1.2) för anpassning av läsningar för att referera V(D)J och C gensekvenser från IMGT databas , utvinning, och klustring av CDR-H3 nukleotid (fil 1: Tabell S1)., HC-CDR3-sekvenser som innehåller frameshifts eller stoppkodon och med mindre än två läsningar filtrerades ut. Vi skapade en HC-LC pairing statistikfil för att visa Parade VH-VK genanvändning i den totala Parade HC-LC genrepertoarer. Värmekartor genererades med hjälp av R och grafiskt visas med hjälp av ggplot2. Därefter identifierades interindividuella TT-specifika HC-CDR3-sekvenser genom att jämföra HC-CDR3-aminosyrasekvenser erhållna från boosterprovet efter Td till tidigare rapporterade TT-specifika HC-CDR3-sekvenser .,
PCR-förstärkning av fullängds HC-och LC-sekvenser
Vi designade en tvåstegs PCR-baserad förstärkningsmetod (ytterligare fil 1: figur S5)för att införliva restriktionsförtunningsplatser till potentiellt TT-specifik HC och LC med fullständig v(D) J-gensekvens. Detta möjliggjorde effektiv kloning av HC-och LC-sekvenser i respektive uttrycksvektorer samt produktion av rekombinanta antikroppar för in vitro-bindande studier., Kort sagt, vi valt ut 14 ihopkopplade HC-LC CDR3 clonotypes erhållits från IgG-sekvensering post-Td booster-vaccin baserat på deras frekvens, para noggrannhet, och vik skillnaden mellan top1 LC-CDR3 och top2 LC-CDR3 ihopkopplade till den givna HC-CDR3 sekvens. Vi extraherade totalt RNA från frysta B-celler isolerade från efter TD booster immunisering med TRIzol reagens (Ambion) rening enligt tillverkarens instruktioner. I det första steget utfördes RT-PCR-förstärkning för varje vald HC – och LC-CDR3 clonotyp separat med dART 1-step RT-PCR kit (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) innehöll HC-och LC V-genspecifika framåtriktade primrar med bsshii-begränsningsställen överhäng tillsammans med enskilda CDR3-specifika omvänd primrar med 18 nukleotider i FR4-regionen vid 0,4 µM-koncentrationer (ytterligare fil 1: Tabell S3 och figur S5), 1× dART 1-steg RT-PCR master buffer mix, 1× dART master enzyme mix och 4.5 ng total RNA., Termo betingelser var följande: omvänd transkription vid 55 ° C under 30 min, initial denaturering vid 95 ° C under 3 min, sedan 23 cykler av denaturering vid 95 ° C under 20 s, glödgning vid 56 ° C under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 90 s, följt av ett slutförlängningssteg vid 72 ° C under 5 min. RT-PCR-produkter renades med hjälp av Agencourt AMPure XP-PCR purification kit (Beckman Coulter) enligt tillverkarens instruktioner och eluerades i 6 mM Tris-cl pH 8.0., I det andra steget användes renade RT-PCR-produkter som mall för PCR-förstärkning med Q5 high-fidelity DNA polymeras (New England Biolabs). Den kapslade PCR master mix (50 µL) innehöll främre primrar som kodade en bsshii restriktionsställe och tre nukleotider av HC eller LC germline gensekvens tillsammans med omvänd primrar som innehåller hela FR4 regionen och nhei/HindIII begränsning överhäng vid 0,4-µM koncentrationer (ytterligare fil 1: Tabell S3 och figur S5), 4 µL renat DNA, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reaktionsbuffert, och 0.,02 U/µL Q5 hifi-DNA-Polymeras (New England Biolabs). Termo betingelser var följande: initial denaturering vid 98 ° C under 3 min, därefter 16 cykler av denaturering vid 98 ° C under 30 s, glödgning vid 69 ° C under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 1 min, följt av ett slutförlängningssteg vid 72 ° C under 5 min. PCR-produkter separerades på en TBE-agarosgel, fullängds HC och LC − ampuller med restriktionsförtunningsplatser extraherades från gelén med Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) och produkterna lagrades vid-20 °C tills vidare användning.,
Kloning och uttryck av rekombinant monoklonala antikroppar
en Begränsning rötning av full längd HC och LC skär och uttryck vektorerna (pCMV-CD30-4IE3_HC och pCMV-CD30-4IE3_LC) utfördes med den begränsning enzymer BssHII, NheI och HindIII (New England Biolabs). De resulterande produkterna laddades på 2% TBE-agarosgeler och band av ~ 5.9 kb för HC vector backbone, 5.3 kb för LC vector backbone, ~ 370 bp för HC-insatser och ~ 340 bp för LC-insatser var storlekvalda på agarosgeler och renade som beskrivits ovan., Ligationer av motsvarande insatser och vektorer för de förstärkta HC-och LC-klonotyperna utfördes med omedelbar klibbig DNA-ligas (New England Biolabs) och omvandlades till ett skott kemiskt kompetenta E. coli TOP10-celler (IBA) enligt tillverkarens instruktioner. Plasmid DNAs isolerades från transformerade kolonier (8-16 kolonier) med hjälp av QIAprep spin miniprep kit (Qiagen); likheter med konsensussekvenserna bekräftades med hjälp av kapillär Sanger-sekvensering., HC och LC plasmid – DNA-sekvenser som matchade närmast konsensussekvenserna överfördes samtidigt till humana embryonala njurcellslinjer HEK 293 T (ATCC, CRL-11268) celler. HEK 293 T-celler odlades med hjälp av rik glukos (4,5 g / L D-glukos) Dulbecco modifierade Eagle Medium (Gibco BRL) kompletterat med värmeinaktiverad ultralåg IgG fetalt bovint serum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Renat plasmid-Dna för ihopkopplade HC och LC clonotypes var co-transfected i 85-95% sammanflytande HEK 293 T-celler med hjälp av PEI (polyethyleneamine, Polysciences)., Kultur supernatanter samlades fyra dagar efter transfektion och TT antigen-specifika klonotyper identifierades genom indirekt ELISA.
Enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA)
Vi utförde indirekta ELISA-analyser för att identifiera mAbs som härrör från den immuniserade probandbindningen till TT-antigen med hjälp av de transfekterade cellkultursupernatanterna. Nunc-Immuno MicroWell 96-samt fasta plattor (Thermo Fisher Scientific) var belagd med 100 µL 10 µg/mL TT antigen (Statens Serum Institut, Köpenhamn, Danmark) i 50 mM karbonat buffer pH 9.,6, inkuberas över natten vid 4 °C, tvättas tre gånger med PBS och blockerade med 2% fettfri torrmjölk (Bio-Rad) i PBS för 150 minuter vid rumstemperatur. Efter blockering sattes 120 µL av 1:2 seriellt utspädda transfekterade supernatanter i PTM (PBS, 0,1% Tween-20, 2% fettfri torkad mjölk) till brunnarna, 350 ng mus Anti-TT mAb (GeneTex) applicerades på en samt en positiv kontroll, och plattor inkuberades i 1 h vid rumstemperatur. Plattorna tvättades tre gånger med PBS – t (0.,1% Tween-20) och 50 µL av en 1:2000 utspädning av get-anti-human kappa LC-HRP av en sekundär antikropp (Thermo Fisher Scientific) har lagts till brunnar, 50 µL av en 1:2000 utspädning av get-anti-mus IgG HC-HRP av en sekundär antikropp (Sigma #A0168) lades till den positiva kontrollen samt, plattorna inkuberades i 2 minuter vid rumstemperatur och tvättas tre gånger med PBS-T. För färg utveckling, vi har lagt 50 µL av one-step Ultra TMB-ELISA substrat (Thermo Fisher Scientific) per tja, inkubera plattorna i 5 minuter vid rumstemperatur, och stannade Ag:Ab bindande reaktionen genom att tillsätta 50 μl 2 M H2SO4., Absorbansen mättes vid 450 nm med den GloMax Multi Detection System (Promega). ELISA-analyser för alla klonotyper utfördes i tre exemplar, värdena normaliserades för att ta bort bakgrundssignaler och fel representerades som standardavvikelser från medelvärdet.
analys av chimerisk ampliconbildning under kapslad PCR
fyra definierade HC-LC-amplikoner genererades genom att förstärka HC och LC från respektive pCMV-plasmider (se ovan) och använda en PCR-monteringsreaktion för att generera de fyra distinkta HC-LC-aggregaten., HC och LC plasmid-Dna kom att användas som mallar för PCR-amplifiering av Top1, Top2, Top3, och Top4 klonat kedja par med hjälp av primrar som är specifika för respektive VH och VK gen familjer och IgG och IgK konstant regioner (fil 1: Tabell S2 och Figur S6a). Renat plasmid-DNA (10 ng) tillsattes till varje 25 µL PCR-reaktion innehållande 0,4 µM av varje primer, 200 µM dNTP-blandning, 1× Q5-reaktionsbuffert och 0,2 U/µL Q5-HiFi-DNA-polymeras., Termisk cykling utfördes med initial denaturering vid 98 °C under 3 min, följt av 25 cykler av denaturering vid 98 °C under 30 s, glödgning/förlängning vid 71 °C under 1 min (för HC plasmid DNA) eller glödgning vid 64 °C under 1 min och förlängning vid 72 ° C under 1 min (för LC plasmid DNA), följt av ett slutförlängningssteg vid 72 ° C under 5 min. PCR-produkter laddades på separata 1% TBE-agarosgeler och separerades med 100 V i 60 min. De önskade DNA-produkterna av ~ 400 bp (för HC) och ~ 350 bp (för LC) var dimensionerade och extraherade från gelén enligt beskrivningen ovan., De renade HC-och LC PCR-produkterna användes som mallar för HC-och LC-montering genom överlappningsförlängning av PCR (ytterligare fil 1: figur S6b). Kortfattat, 5 ng av varje HC och motsvarande ihopkopplade LC DNA lades till varje 50 µL PCR-reaktion som innehåller 1× dART-1-steg-RT-PCR-master buffert (Roboklon), 2× dART master enzym (Roboklon) och 0,4 µM av varje IgG och IgK konstant regionen primer (fil 1: Tabell S2)., Termisk cykling utfördes med RT-inaktivering vid 95 °C i 3 min, följt av tre denatureringscykler vid 95 °C i 20 s, glödgning vid 56 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C i 2 min, följt av 25 denatureringscykler vid 95 °C i 20 S, glödgning vid 56 ° C i 30 s och förlängning vid 72 ° C i 4 min, följt av ett slutförlängningssteg vid 72 °C i 5 min. Monteringsprodukterna lastades på 1% TBE-agarosgeler och separerades med 100 V i 45 min. Monteringsprodukterna av ~ 750 bp var dimensionerade och extraherade från agarosgelen enligt beskrivningen ovan., De individuellt monterade HC-LC klonala paren sammanfogades och användes som mall för kapslad PCR-förstärkning med primrar som är specifika för IgG och IgK-konstanta regioner (ytterligare fil 1: Tabell S2, figur S6c). De kapslade PCR-reaktionerna och termiska cykelförhållandena var desamma som beskrivs i avsnittet ”kapslade PCR-förstärkning av humana B-cellmonteringsprodukter” förutom att PCR-förstärkningen utfördes i 25 cykler. PCR-produkter laddades på 1% TBE-agarosgeler, separerade med 100 V för 60 min och önskade produkter av ~ 720 bp extraherades enligt beskrivningen ovan., Sekvenseringsbibliotek från de enskilda sammansättningarna och från de blandade sammansättningarna efter att kapslade PCR förbereddes efter Illumina TruSeq DNA – provberedningsguiden och 2 × 250-basparade slutläsningar genererades med Illumina MiSeq-plattformen.