”RNA-sekvensering är en hög genomströmning nästa generations sekvenseringsmetod som används för att analysera genuttryck och transcriptomics studier.”
ribonukleinsyra är en typ av nukleinsyra som huvudsakligen är involverad i genuttrycket, genreglering och kodning / avkodning av information.
mRNA – messenger RNA är en kodningssekvens av en gen som är inblandad i syntesen av protein, ungefär 4% av RNA-poolen består av mRNA medan resten är icke-kodande RNA.,
även om cirka 90% av RNA inte är kodande, är de viktiga för att utföra olika funktioner.
till exempel
- tRNA – överför aminosyran till ribosomal-webbplatsen, medan översättningen.
- rRNA – ribosomal RNA hjälper i översättning.
- microRNA – genuttryck och reglering av genuttryck.
- siRNA – skyddar en cell från de exogena RNAs.
en mRNA är en enkelsträngad nukleinsyra transkriberad från en gen och från vilken proteinet översätts.,
mRNA eller transkriptet innehåller endast kodningssekvenserna från en gen. Således har den bara de sekvenser som krävs vid proteinbildningen.
hädanefter, genom att analysera ett mRNA, kan uttrycksmönstret för den relaterade genen bestämmas.
total rna-undersökning ger oss också en uppfattning om vilka gener som är kopplade till proteinbildningen och vilka inte är.
betyder att mängden totalt RNA, mRNA och ncRNA kan bestämmas genom att studera det totala RNA.,
Transkriptomics är studien av hela mRNA – ofta kallad transkriptomer eller total RNA närvarande i en cell-eller cellpopulation.
genom att analysera transkriptom av en cell kan hela gruppen av genuttrycket undersökas. En av de viktiga teknikerna som används i transcriptomics studier är RNA-sekvensering.
en organisms transkriptom är större, komplex och mer osäker, till skillnad från genomet.
transkriptomet varierar i olika tillstånd och en annan miljö., Livsstil, kost, motion, miljö, förhållanden och andra yttre faktorer spelar en viktig roll i transkriptomreglering.
här i RNA-sekvenseringen sekvenseras och kvantifieras cDNA-syntetiseringen från mRNA i en sekvenserare. I den här artikeln kommer vi att diskutera RNA-sekvenseringen endast men innan det läser vår tidigare artikel om transcriptomics: Vad är Transcriptomics?,
viktiga ämnen:
principen om RNA-sekvensering:
RNA-sekvensering är en nästa generation, hög genomströmning RNA-sekvensering och kvantifieringsmetod som används för att studera transkriptomik och genuttryck.
en cDNA är konstruerad från total mRNA genom processen med omvänd transkription och fragmenterad. Samtidig, adapterligering och biblioteksförberedelse praktiseras innan du gör sekvensering.
sekvenseraren läser och kvantifierar cDNA-komplementet till mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
isolering av RNA är en tråkig process i jämförelse med DNA-isolering. RNA kan vara nedbrytning lätt. Risken för förorening är också hög i RNA-isolering.
därför måste extra försiktighet iakttas samtidigt som man isolerar RNA och experthand in krävs för att göra det.
högavkastande pure RNA är måste kräva för RNA-sekvensering.
renheten och kvantiteten av RNA mäts med hjälp av Nanodrop eller qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
nu är vårt rna-prov redo för nästa steg.,
omvänd transkriptas PCR:
en annan innovativ uppsättning för RNA-sekvensering är att göra omvänd transkriptas PCR där RNA är omvänd transkriberas till DNA.
genom att använda en speciell typ av polymeras som kallas DNA-omvänt transkriptas syntetiseras cDNA från mRNA.
Läs mer om RT PCR här: omvänd transkriptas PCR.
andra strängen cDNA syntes:
Efter cDNA syntetiseras från mRNA, den andra strängen DNA-syntes krävs. För detta utförs PCR med användning av det normala Taq-DNA-polymeraset i konventionellt PCR.,
polymerasen lägger till dNTPs till den växande DNA-strängen med hjälp av primeruppsättningen.
biblioteksförberedelse:
det första steget i biblioteksförberedelsen eller ngs-biblioteksförberedelsen börjar med fragmenteringen.
användning av den speciella typen av restriktions endonukleaser hela uppsättningen ds cDNA är fragmenterad för NGS.
notera:
bibliotekets förberedelse varierar från plattform till plattformar som vissa fragment mRNA innan de utför omvänd transkriptas medan vissa utför det senare efter beredningen av cDNA.,
i det sista steget i bibliotekets förberedelse ligeras ändarna med adaptersekvenserna och förstärks för att reparera ändarna. da-tailing är valfritt vid mRNA bibliotek.
Biblioteksrening:
hela biblioteket renas med hjälp av klar att använda DNA-reningssatsen.
i det sista steget är det mycket viktigt att rena hela fragmentbiblioteket för att bibliotekets koncentration bedöms med hjälp av den kvantitativa PCR-eller bioanalysatorn.,
notera:
för en nybörjare tror jag att bibliotekspreparat och DNA-fragmentering är mycket svårt att förstå, så vi tror att vi borde skriva en hel artikel om genomisk DNA-fragmentering, bibliotekspreparat och dess betydelse i NGS.
ändå låt oss gå vidare,
i nästa steg skickas provet av fragmenterat DNA för sekvensering.
DNA-sekvensering:
nu är provet sekvenserat i NGS-maskinen med hög genomströmning som läser sekvensen samt kvantifierar nukleinsyran också.,
kemin bakom sekvensering av cDNA beror på vilka plattformar vi använder, även om den allmänt använda metoden är användningen av fluorescenskemi.
i sekvensen är enskilda fragment ”lästa” separat och sekvenserade. De slutliga uppgifterna skickas till bioinformatics lab för eftersekvensanalys.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | liten hårnål RNA | syntetisk RNA molekyl hjälper i genreglering och kontrollerande genuttryck. |
Transcriptome dataanalys:
en av de tråkiga jobben, som vi redan diskuterat i föregående artikel är transcriptome dataanalys och tolkning av resultat. NGS-data är enorma och mer komplexa.,
uppriktigt sagt är det inte möjligt att undervisa dataanalys av transcriptomics, man borde behöva ta praktisk övning för att lära sig, men jag kommer ändå att försöka lära dig vad som är nästa i denna process.
olika fragment sekvenseras i maskinen och data samlas in. I nästa steg, baserat på fragmentens flankeringsområde, är de så kallade ”contings” ordnade för att få skarvvarianter.
i nästa steg jämförs transkriptomet med referenssekvensen eller kan monteras de novo.,
en kort översikt över hela processen med RNA-seq.
hela transkriptomsekvensering:
hela transkriptom av en cell eller vävnad – alla RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, micrna och siRNA) sekvenseras och kvantifieras. Med andra ord kan vi säga att både roman, såväl som kända transkript, kan sekvenseras.
för att göra det extraheras hela uppsättningen RNA från vävnadsprovet.,
Target RNA sequencing:
en genspecifik, kluster av genspecifika, en pathway-specifik eller sjukdomsrelaterade transkriptomer sekvenseras i målspecifika RNA-sekvensering.
Target RNA-sekvensering är billigare och mer exakt än hela transkriptomsekvenseringen. Dessutom krävs mindre mängd rna-prov för att göra experimentet.
liten RNA-sekvensering:
en av de mest framväxande tekniken i RNA-sekvensering är att studera cellens mindre icke-kodande RNA eftersom de är associerade med så många funktioner i ett genom.,
mindre RNA-molekyler såsom miRNA, siRNA och piRNA kan kvantifieras och sekvenseras genom ngs-baserad rna-sekvenseringsmetod för olika tillämpningar.
mRNA-sekvensering:
sekvensera hela mRNA-transkriptet med hjälp av Poly(a) – svansval som används för genuttrycksstudier. Användning av mRNA-sekvensering känd som ny transkriptförändring kan detekteras.
fördelarna med RNA-sekvensering:
en av de pivotala fördelarna med RNA-sekvensering är att det inte finns något behov av tidigare sekvensinformation., Eftersom hela processen inte är baserad på sondbaserad kemi krävs inte tidigare sekvensinformation för att designa sonden här.
mer exakt och känslig genuttrycksstudie kan göras.
bredare dynamiskt omfång.
fånga både kända och nya ändringar av transkriptet, även om ingen sekvensinformation är tillgänglig.
även om det inte finns någon information om referenssekvensen, kan RNA-sekvensering användas för alla arter.
relaterat: syntetiskt genom – metoder, applikationer och utmaningar.,
slutsats:
Sammanfattningsvis kan vi säga att RNA seq-metoden är mer avancerad och korrekt jämfört med mikroarrayen. De novo mutationer kan också upptäckas med hjälp av den.