Vad är PCR? – Nybörjarguiden

PCR är tekniken för moderna molekylärbiologiska laboratorier. Om du behöver kopiera, sekvensera eller kvantifiera DNA behöver du veta PCR. Kort sagt, PCR (polymerase chain reaction) är en biokemisk teknik som använder termocykling och enzymer för att snabbt och tillförlitligt kopiera DNA, och det uppfanns i en blixt av inspiration av en vetenskapsman körning på Motorväg 128 från San Francisco till Mendocino.,

den här artikeln ger en kort, grundläggande översikt över PCR, med några tips som hjälper dig att undvika de vanligaste fallgroparna. Om du är ny, eller relativt ny till PCR så är det här för dig. (Och även om du är erfaren på PCR är det väl värt en läsning för att uppdatera, och kanske ta ett tips eller två!).

grundläggande PCR-ingredienser:

polymeras

polymeraser är enzymer som under rätt förhållanden kan montera nya DNA-strängar från mall-DNA och nukleotider. Den ursprungliga PCR-reaktionen var besvärlig eftersom de höga temperaturerna som behövs för att denature DNA skulle döda polymeraserna., Detta innebar att efter varje uppvärmningscykel behövde nya polymeraser manuellt läggas till reaktionen-en dyr strävan. Men i modern PCR är detta inte ett problem, eftersom polymeraserna som används i modern PCR vanligtvis kommer från en av två termofila bakteriekällor, Thermus aquaticus eller Pyrococcus furiosus. Dessa polymeraser respektive Taq (uttalad ”tack”) och PFU (uttalad ”P-F-U”) tål lätt de höga temperaturerna i samband med en PCR-reaktion., Kommersiella Taq-och PFU-polymeraser är konstruerade för hastighet, trohet, processivitet (förmåga att slutföra långa läsningar) och deras förmåga att läsa GC-rika mallar. Företag kommer ständigt ut med nya polymeraser. Därför, inte nöja sig med ”vad är i frysen”, men shoppa runt för bästa kommersiella polymeras för din PCR behov. Prata också med din lokala säljare, eftersom de ofta kan ge ut fria polymerasprover, så att du kan bestämma vad som är bäst för dig.

mall DNA

detta är DNA som du designar dina primers till., Det är DNA som din polymeras kommer att läsa och kopiera. Din mall DNA kan vara genomisk, plasmid eller cDNA, men oavsett din källa kvalitet räknas. Ju mer intakt och renare din mall DNA desto lättare är det att få bra PCR resultat. Tänk också på den ideala mängden DNA beror på din källa, vanligtvis 1 pg-1 ng plasmid DNA eller 1 ng – 1 µg genomiskt DNA per PCR-reaktion.

Primers

Primers är korta fragment av syntetiserat DNA som binder till din mall DNA. Du måste designa en ”framåt” primer och en” omvänd ” primer., Din forward primer betecknar början på din PCR. Denna primers sekvens är densamma som din 5-3 mall DNA-sekvens. Din omvänd primer betecknar slutet på din PCR. Denna primers sekvens är det omvända komplementet av din mall DNA. I allmänhet är primers 18-22 baspar långa. Men viktigare än deras längd är smälttemperaturen hos dina primers. Smälttemperaturen hos dina primers ska vara 54-60 ° C och så lika som möjligt för varandra., Det finns massor av online räknare som kan beräkna primer glödgning temperaturer, och de flesta företag som syntetiserar primers leverera sådana räknare.

nukleotider

som monomerer av DNA är nukleotider nödvändiga för att göra DNA-kopior. För de flesta DNA PCr du kommer att använda deoxynucleosid trifosfater (dNTPs). Du kan köpa dessa separat eller som en dGTP, dCTP, dATP och dTTP mix. Vad du än köper, kom ihåg att nukleotider är mycket känsliga för att frysa / tina cykler. Därför är det bäst att alltid skapa små alikvoter av dina dNTPs., Se också till att du lagrar dem ordentligt – använd inte en frostfri frys som går igenom automatiska avfrostningscykler.

buffert

de flesta kommersiella polymeraser levereras med sin idealiska buffert. Dessa buffertar levererar inte bara rätt pH, men de har alltid tillsatser som magnesium, kalium eller DMSO, vilket hjälper till att optimera DNA-denaturering, renaturing och polymerasaktivitet. Det kommer att finnas mer om dessa tillsatser i en kommande artikel.

Termocycling:

det är här magin händer., Alla ovanstående ingredienser läggs till ett PCR-rör och röret är termocyklat. För att uppnå thermocycling när PCR först uppfanns individuella PCR-rör manuellt förflyttades mellan uppvärmda vattenbad. (Och du tror att ditt bänkarbete är tråkigt!) Nu, tack vare uppfinningen av ”Mr Cycles”, den första termocykelmaskinen, temperaturreglering görs nu automatiskt av termocykler. Följande är en typisk PCR-termocyklerprofil:

initiering

i detta steg upphettas reaktionen till 94-96°C i 30 sekunder till flera minuter., Detta steg görs vanligtvis bara en gång i början av din PCR-reaktion. Detta steg är viktigt för att aktivera Hot-start polymerases, om du använder en sådan polymeras, och att denature din mall DNA. Tänk på att om din mall GC-innehåll är hög kan du behöva utföra en extra lång initiering steg.

denaturering (upprepad 15-40 gånger)

i detta steg upphettas reaktionen till 94-98°C i 15-30 sekunder. Detta steg denaturerar ditt DNA och primers, vilket gör det möjligt för dem att glödga till varandra i nästa steg.,

glödgning (upprepade 15-40 gånger)

i detta steg sänks reaktionens temperatur snabbt till 50-64°C i 20-40 sekunder. Temperaturen i detta steg måste vara tillräckligt låg för att dina denaturerade primers kan bilda Watson-Crick baspar med din mall DNA. Men tillräckligt hög för att endast de mest stabila (perfekt Parade) dubbelsträngade DNA-strukturerna kan bildas. Vanligtvis är denna perfekta glödgningstemperatur några grader lägre än smälttemperaturen för ditt primerpar. Även under detta steg din polymeras binder till din primer / mall DNA-komplex., Även om din polymeras inte börjar läsa förrän temperaturen höjs i nästa steg.

förlängning eller förlängning (upprepade 15-40 gånger)

i detta steg din reaktion värms snabbt till 72-80 ° C. Detta är när din polymeras börjar läsa (i 5-3 riktning) och kopiera din mall DNA (i 3-5direction). Den högre temperaturen under detta steg minskar icke-specifika primer / mall DNA interaktioner, vilket ökar specificiteten av din reaktion., Den exakta temperaturen bestäms emellertid av preferensen för ditt polymeras, så läs din förpackning. Steglängden beror på hur lång din DNA-kopia. Typiskt kan DNA-polymeras kopiera 1,000 baspar per minut. Därför måste du tillåta minst 1 minut förlängningstid per 1000 baser. I slutet av denna inkubation kommer nya dubbelsträngade bitar av DNA att ha skapats, bestående av både Mall och nytt DNA.

steg 2-4 upprepas sedan 15-40 gånger

det är sant att ju fler cykler du programmerar desto fler DNA-kopior du skapar., Det finns dock en övre gräns. Vid något tillfälle blir tillgängliga fria nukleotider begränsande och för tidigt stympade DNA-kopior kan bli ett problem. Så bli inte girig med din cykling. Mindre men bra ren PCR produkt är att föredra framför massor av smutsig produkt.

slutlig förlängning

detta är ett valfritt men ofta rekommenderat steg. I detta steg hålls reaktionen vid 70-74 ° C i flera minuter. (Vanligtvis använder du samma temperatur som du använde vid förlängning eller Förlängningssteg.) Detta steg gör det möjligt för polymeraserna att avsluta behandlingen oavsett sträng de är för närvarande på., Detta valfria steg kan bidra till att minska antalet avkortade kopior i slutprodukten.

Final hold

din reaktion är nu klar. Eftersom hela processen kan ta några timmar görs PCR-reaktioner ofta över natten eller när du annars har gått bort.det rekommenderas att du programmerar din termocykler för att hålla din PCR-produkt vid 4°C tills du kommer tillbaka. Vid vilken tidpunkt kan du analysera eller använda din produkt, eller överföra den till mer lämplig långtidsförvaring som ditt kylskåp.

lycka till och lycklig PCR-ing!