Was ist PCR? – Der Anfängerleitfaden

PCR ist DIE Technik moderner molekularbiologischer Labore. Wenn Sie DNA kopieren, sequenzieren oder quantifizieren müssen , müssen Sie PCR kennen. Kurz gesagt, PCR (Polymerase Chain Reaction) ist eine biochemische Technik, die Thermocycling und Enzyme verwendet, um DNA schnell und zuverlässig zu kopieren, und es wurde in einem Blitz der Inspiration von einem Wissenschaftler auf der Autobahn 128 von San Francisco nach Mendocino erfunden.,

Dieser Artikel gibt einen kurzen, grundlegenden Überblick über PCR, mit ein paar Tipps, die Ihnen helfen, die häufigsten Fallstricke zu vermeiden. Wenn Sie neu oder relativ neu in PCR sind, dann ist dies für Sie. (Und selbst wenn Sie bei PCR erfahren sind, ist es eine Lektüre wert zu aktualisieren, und vielleicht ein oder zwei Tipps greifen!).

Grundlegende PCR-Inhaltsstoffe:

Polymerase

Polymerasen sind Enzyme, die unter den richtigen Bedingungen neue DNA-Stränge aus Template-DNA und Nukleotiden zusammensetzen können. Die ursprüngliche PCR-Reaktion war umständlich, da die hohen Temperaturen, die zum Denaturieren der DNA erforderlich waren, die Polymerasen abtöten würden., Dies bedeutete, dass nach jedem Heizzyklus neue Polymerasen manuell zu der Reaktion hinzugefügt werden mussten– ein teures Unterfangen. In der modernen PCR ist dies jedoch kein Problem, da die in der modernen PCR verwendeten Polymerasen normalerweise aus einer von zwei thermophilen Bakterienquellen stammen, Thermus aquaticus oder Pyrococcus furiosus. Diese Polymerasen Taq (ausgesprochen „Tack“) und Pfu (ausgesprochen „P-F-U“) widerstehen leicht den hohen Temperaturen, die mit einer PCR-Reaktion verbunden sind., Kommerzielle Taq – und Pfu-Polymerasen wurden für Geschwindigkeit, Wiedergabetreue, Verarbeitbarkeit (Fähigkeit, lange Lesevorgänge abzuschließen) und ihre Fähigkeit, GC-reiche Vorlagen zu lesen, entwickelt. Unternehmen kommen ständig mit neuen Polymerasen heraus. Geben Sie sich daher nicht mit „was auch immer sich in Ihrem Gefrierschrank befindet“ zufrieden, sondern suchen Sie nach der besten kommerziellen Polymerase für Ihre PCR-Anforderungen. Sprechen Sie auch mit Ihrem lokalen Vertriebsmitarbeiter, da diese häufig kostenlose Polymerase-Proben ausgeben können, damit Sie entscheiden können, was für Sie am besten ist.

Template DNA

Dies ist die DNA, zu der Sie Ihre Primer entwerfen., Es ist die DNA, die Ihre Polymerase lesen und kopieren wird. Ihre Vorlage DNA kann genomisch sein, Plasmid oder cDNA, aber was auch immer Ihre Quelle Qualität zählt. Je intakter und reiner Ihre Vorlage DNA desto einfacher ist es, gute PCR-Ergebnisse zu erhalten. Denken Sie auch daran, dass die ideale Menge an DNA von Ihrer Quelle abhängt, normalerweise 1 pg – 1 ng Plasmid – DNA oder 1 ng-1 µg genomischer DNA pro PCR-Reaktion.

Primer

Primer sind kurze Fragmente synthetisierter DNA, die an Ihre Template-DNA binden. Sie müssen einen „Vorwärts“ – Primer und einen „Rückwärts“ – Primer entwerfen., Ihr Forward Primer bezeichnet den Start Ihrer PCR. Die Sequenz dieses Primers ist die gleiche wie Ihre 5-3-Vorlagen-DNA-Sequenz. Ihr Reverse Primer bezeichnet das Ende Ihrer PCR. Die Sequenz dieses Primers ist das umgekehrte Komplement Ihrer Template-DNA. Im Allgemeinen sind Grundierungen 18-22 Basispaare lang. Wichtiger als ihre Länge ist jedoch die Schmelztemperatur Ihrer Primer. Die Schmelztemperatur Ihrer Primer sollte 54-60°C und so ähnlich wie möglich sein., Es gibt viele Online-Rechner, die Primerglühtemperaturen berechnen können,und die meisten Unternehmen, die Primer synthetisieren, liefern solche Rechner.

Nukleotide

Als Monomere der DNA sind Nukleotide für die Herstellung von DNA-Kopien notwendig. Für die meisten DNA-PCRs verwenden Sie Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs). Sie können diese separat oder als dGTP -, dCTP -, dATP-und dTTP-Mix kaufen. Was auch immer Sie kaufen, denken Sie daran, dass Nukleotide sehr empfindlich auf Gefrier – /Auftauzyklen reagieren. Daher ist es am besten, immer kleine Aliquots Ihrer dNTPs zu erstellen., Stellen Sie auch sicher, dass Sie sie richtig lagern – verwenden Sie keinen frostfreien Gefrierschrank, der automatische Abtauzyklen durchläuft.

Puffer

Die meisten kommerziellen Polymerasen werden mit ihrem idealen Puffer geliefert. Diese Puffer liefern nicht nur den richtigen pH-Wert, sondern enthalten immer Additive wie Magnesium, Kalium oder DMSO, die zur Optimierung der DNA-Denaturierung, Renaturierung und Polymeraseaktivität beitragen. Es wird mehr über diese Zusätze in einem kommenden Artikel geben.

Thermocycling:

Hier passiert die Magie., Alle oben genannten Zutaten werden einem PCR-Röhrchen zugesetzt und das Röhrchen wird thermocycelt. Um das Thermocycling bei der ersten PCR-Erfindung zu erreichen, wurden einzelne PCR-Rohre manuell zwischen beheizten Wasserbädern bewegt. (Und Sie denken, Ihre Bankarbeit ist mühsam!) Nun, dank der Erfindung von „Mr. Cycles“, der ersten Thermocycling-Maschine, erfolgt die Temperaturregelung jetzt automatisch durch Thermocycler. Es folgt ein typisches PCR-Thermocyclerprofil:

Initialisierung

In diesem Schritt wird die Reaktion 30 Sekunden bis einige Minuten auf 94-96°C erhitzt., Dieser Schritt wird normalerweise nur einmal am Anfang Ihrer PCR-Reaktion durchgeführt. Dieser Schritt ist wichtig, um Hot-Start-Polymerasen zu aktivieren, wenn Sie eine solche Polymerase verwenden und Ihre Template-DNA denaturieren. Beachten Sie, dass Sie, wenn der Inhalt Ihrer Vorlage hoch ist, möglicherweise einen extra langen Initialisierungsschritt ausführen müssen.

Denaturierung (15-40 mal wiederholt)

In diesem Schritt wird die Reaktion 15-30 Sekunden lang auf 94-98°C erhitzt. Dieser Schritt denaturiert Ihre DNA und Primer, wodurch sie im nächsten Schritt miteinander glühen können.,

Glühen (15-40 Mal wiederholt)

In diesem Schritt wird die Temperatur Ihrer Reaktion für 20-40 Sekunden schnell auf 50-64°C gesenkt. Die Temperatur in diesem Schritt muss so niedrig sein, dass Ihre denaturierten Primer Watson-Crick-Basenpaare mit Ihrer Template-DNA bilden können. Aber hoch genug, dass sich nur die stabilsten (perfekt gepaarten) doppelsträngigen DNA-Strukturen bilden können. Normalerweise ist diese perfekte Glühtemperatur einige Grad niedriger als die Schmelztemperatur Ihres Primerpaares. Auch während dieses Schritts bindet Ihre Polymerase an Ihren Primer / Template-DNA-Komplex., Ihre Polymerase beginnt zwar erst zu lesen, wenn die Temperatur im nächsten Schritt erhöht wird.

Verlängerung oder Verlängerung (15-40 Mal wiederholt)

In diesem Schritt wird Ihre Reaktion schnell auf 72-80°C erhitzt Dies ist, wenn Ihre Polymerase beginnt zu lesen (in der 5-3-Richtung) und Kopieren Sie Ihre Vorlage DNA (in der 3-5direktion). Die höhere Temperatur während dieses Schritts reduziert unspezifische Primer / Template-DNA-Wechselwirkungen und erhöht so die Spezifität Ihrer Reaktion., Die genaue Temperatur wird jedoch durch die Präferenz Ihrer Polymerase bestimmt, lesen Sie also Ihre Verpackung. Die Länge dieses Schritts hängt davon ab, wie lang Ihre DNA-Kopie sein wird. Typischerweise kann DNA-Polymerase 1.000 Basenpaare pro Minute kopieren. Daher müssen Sie mindestens 1 Minute Verlängerungszeit pro 1.000 Basen zulassen. Am Ende dieser Inkubation werden neue doppelsträngige DNA-Stücke erstellt, die sowohl aus Schablone als auch aus neuer DNA bestehen.

Schritt 2-4 werden dann 15-40 Mal wiederholt

Je mehr Zyklen Sie programmieren, desto mehr DNA-Kopien erstellen Sie., Es gibt jedoch eine Obergrenze. Irgendwann werden verfügbare freie Nukleotide limitierend und vorzeitig abgeschnittene DNA-Kopien können zu einem Problem werden. Also werde nicht gierig mit deinem Fahrrad. Weniger, aber gutes sauberes PCR-Produkt ist vielen schmutzigen Produkten vorzuziehen.

Enddehnung

Dies ist ein optionaler, aber oft empfohlener Schritt. In diesem Schritt wird die Reaktion einige Minuten bei 70-74°C gehalten. (Normalerweise verwenden Sie die gleiche Temperatur wie im Dehnungs-oder Verlängerungsschritt. In diesem Schritt können die Polymerasen das Lesen des Strangs beenden, auf dem sie sich gerade befinden., Dieser optionale Schritt kann dazu beitragen, die Anzahl der abgeschnittenen Kopien in Ihrem Endprodukt zu reduzieren.

Final hold

Ihre Reaktion ist nun abgeschlossen. Da der gesamte Prozess einige Stunden dauern kann, werden PCR-Reaktionen oft über Nacht oder wenn Sie anderweitig zurückgetreten sind; Es wird empfohlen, dass Sie Ihren Thermocycler so programmieren, dass Ihr PCR-Produkt bis zur Rückkehr bei 4°C gehalten wird. Zu diesem Zeitpunkt können Sie Ihr Produkt analysieren oder verwenden oder in eine geeignetere Langzeitlagerung wie Ihren Kühlschrank überführen.

Viel Glück und glückliche PCR-ing!