16S rRNA-gensekventering bruges ofte til identifikation, klassificering og kvantificering af mikrober inden for komplekse biologiske blandinger, såsom miljøprøver (e.havvand) og tarmprøver (e. human gut microbiome)., 16S rRNA-genet er en stærkt bevaret komponent i det transkriptionelle maskineri af alle DNA-baserede livsformer og er således meget velegnet som et målgen til sekventering af DNA i prøver, der indeholder op til tusinder af forskellige arter. Universelle PCR-primere kan designes til at målrette mod de bevarede regioner i 16 ‘ erne, hvilket gør det muligt at forstærke genet i en lang række forskellige mikroorganismer fra en enkelt prøve. Bekvemt består 16S rRNA-genet af både bevarede og variable regioner (fig. 1)., Mens den bevarede region muliggør universel forstærkning, tillader sekventering af de variable regioner diskrimination mellem specifikke forskellige mikroorganismer, såsom bakterier, archaea og mikrobiel eukarya. Identifikation af virus kræver metagenomic sekventering (direkte sekventering af det samlede DNA, der er ekstraheret fra en mikrobielle samfund) på grund af den fylogenetiske markør-gen, 16S.
Fig 1 – 1,5 kb 16S rRNA genet af E. coli, der viser de ni variable regioner, der gør det til et ideelt mål som et fylogenetisk markør-gen.,
oprindeligt krævede undersøgelser af miljøprøver dyrkning og isolering af arter til identifikation, en besværlig og tidskrævende proces. Koblingen af 16S rRNA PCR med næste generations sekventering har imidlertid gjort det muligt at studere mange prøver til lave omkostninger. Tidlige 16 ‘ ere rRNA-sekventeringsundersøgelser har allerede fundet mange sekvenser, der ikke hører til nogen kendte dyrkede arter, hvilket indikerer, at der er adskillige ikke-isolerede organismer, og at dyrkningsbaserede metoder kun finder en lille procentdel af de bakterielle og arkaeale arter i en prøve., Derudover, med multiple .ing af mange prøver og høj dybde af dækning, der ydes af dagens næste gen-platforme, vi kan nu analysere prøver fra omfattende tidsserier for at kvantificere mikrobiel samfundsdynamik på tværs af mange steder, eller producere detaljerede 3D-kort over mikrobielle samfund, samt undersøge, om ændringer i sjældne eller rigelige arter er forbundet med sundhed og sygdom.
Fig 2 – clustering af 5′ og 3′ læser fra forskellige miljøprøver viser, at prøver fra en given miljøtype klynge sammen godt.,
læser fra næste gen sekventering kan sprænges mod kuraterede databaser såsom Ribosomal Database Project (RDP), Greengens og SILVA til identifikation og klassificering. Relaterede sekvenser er” grupperet ” og antallet af repræsentanter for hver klynge tælles. Klynger af lignende sekvenser betegnes som “operationelle taksonomiske enheder” (OTUs). OTU-tællinger opsummeres i en tabel med relative mængder for hver organisme i hver prøve., Til dato, flere analyserørledninger er blevet udviklet til analyse af 16S rRNA gensekvens data og to almindeligt anvendte rørledninger er andiime og Mothur. QIIME tager brugerne fra deres rå sekventering output gennem de indledende analyser, f.eks OTU picking, taksonomiske opgave, og opførelsen af fylogenetiske træer fra repræsentant sekvenser af OTUs, og gennem downstream statistisk analyse, visualisering og produktion af publikation-kvalitet grafik.,
LC Sciences tilbyder en omfattende 16SrRNA gensekventeringstjeneste til identifikation og klassificering af arter i mikrobielle prøver. Vi bruger en dual .one (amplified zonesones V3 + V4) 16S rDNA fragment amplification strategi, sekvens på branchens førende Illumina mise.platform og give omfattende dataanalyse herunder: sekventering data output statistik, sekvens clustering i operationelle taksonomiske enheder (OTU), mangfoldighedsanalyse, arter klassificering og overflod analyse.,
for nylig brugte en af LC Sciences’ kunder 16S rRNA-gensekventering til at studere luftmikrobiel udbredelse i forurenede områder, hvor ugunstige vejrforhold forårsager en dobbelt forurening af støv og smog.