cellelinjer
HEK 293T cellelinjen blev opnået fra den amerikanske Type Culture Collection (ATCC CRL-3216). Musehybridomacellelinjer KT13 og KT22 blev opnået fra Udviklingsundersøgelserne Hybridoma Bank (DSHB). Begge cellelinjer blev deponeret til DSHB af Ka .umasa Takeda og Asako Sugimoto (dshb hybridomaprodukterne KT13 og KT22)., Mus hybridoma cellelinje 5E4 / 1F1 blev venligst leveret af Miha Kosma and og Vladkauriurin Šerbec (University of Ljubljana). HEK 293T og hybridomaceller blev dyrket i DMEM (Gibco) suppleret med 13% FBS (Gibco), 1 Penic Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher) og 1.Glutama. (Gibco). Antistof-HC-og LC-sekvenser fra individuelle hybridomer blev bestemt ved revers transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) og kapillærsekventering (Eurofins Genomics).,
Cyclohe andimidbehandling og mikrosompræparation
alle pipettetrin blev udført på is, og centrifugeringer blev udført ved 4 C C under anvendelse af en Eppendorf 5810R centrifuge med fast vinkelrotor F-45-30-11. Protein LoBind 1, 5 mL centrifugerør (Eppendorf) blev brugt til at minimere celleadhæsion til rørvæggene. HEK 293T-celler( 1 million), musehybridomaceller (1 million af 5E4, KT13 og KT22-celler blandet i forholdet 1:1:1), ARH-77 leukæmiceller (ATCC CRL – 1621, 1 million) eller frisk isolerede humane CD19+ B-celler fra præ-og Post Td-booster-immuniseringsprøver (1.,5 millioner hver) blev resuspenderet i 1 mL PBS med 50 µg / mL cyclohe .imid og inkuberet i 10 minutter for at stoppe ribosomer med tilhørende messenger RNA ‘ er (mRNA) ved det grove endoplasmatiske retikulum. Cellerne var pelleteret med 300 g i 10 min ved 4 °C og resuspenderet ved pipettering 15× op og ned i 120 µL high-density lysis buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,2, 110 mM kaliumacetat, 5 mM magnesium-acetat, 1 mM EGTA, 25% saccharose , 5% glycerol, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1× komplet EDTA-gratis proteasehæmmer cocktail , 0,1 mg/mL cycloheximide, 0.015% digitonin, og 400 U/mL RiboLock RNase-hæmmer )., Celle – og organellelyse blev afsluttet ved inkubation i 10 minutter på is. Hver homogenat blev opdelt i to 55 pi alikvoter og overført til to friske protein LoBind rør. Rørene blev centrifugeret ved 600 g i 3 minutter ved 4 C C til pelletskerner og celleaffald. I alt 40 µL supernatant fra hvert rør, indeholdende membranfraktioner og cytosol, blev overført til friske Proteinlobindrør, og saccharosekoncentrationen blev fortyndet til 0,37–0,40 M (12-13% w/w) ved tilsætning af 40 µL nukleasefrit vand. Mikrosomer blev derefter sedimenteret ved centrifugering med 20.800 g i 120 min ved 4 C. C., De cytosolholdige supernatanter blev kasseret, og membranpellets blev resuspenderet ved pipettering 10 up op og ned i 85 µL vaskebuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7, 2, 110 mM kaliumacetat, 2, 5 mM magnesiumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM 1,4-dithiothreitol, 1.komplet EDTA-fri proteaseinhibitorcocktail, 0, 1 mg/mL cyclohe .imid, 0, 004% digitonin og 400 U/ml RiboLock-Rnaseinhibitor). Mikrosomerne blev sedimenteret igen ved centrifugering med 20.800 g i 60 minutter ved 4 C. C., Supernatanter blev kasseret, og mikrosompellets blev resuspenderet i 20 µL vaskebuffer og holdt på is indtil videre brug.
transmissionselektronmikroskopi
sample alikvoter af 3, 5 µL resuspenderede Hek 293T-mikrosomer blev påført frisk glødudladet Quanuantifoil-gitter (Quanuantifoil, Tyskland) dækket med en yderligere 2 nm carbonunderstøtningsfilm og flashfrosset i flydende Ethan under anvendelse af et Vitrobot-stempel (Fei). Prøver blev afbildet på et tecnai Spirit transmission electron microscope (Fei), der blev betjent ved 120 kV udstyret med et 2.2 K Eagle CCD-kamera (Fei)., Mikrografer blev registreret under cryo-lavdosisbetingelser ved 42.000 nominal NOMINEL forstørrelse (pi .elstørrelse ved objektskala: 5.2 Å/p.) Ved anvendelse af en defokus på − 2 til − 4 µm. Dataindsamling blev udført enten manuelt eller fuldt automatisk ved hjælp af Leginon .
Emulsion RT-PCR-samling under anvendelse af musehybridomamikrosomer
Vi fortyndede 16 µL resuspenderede mikrosomer fra blandede hybridomer 5E4, KT13 og KT22 i 184 µL RT-PCR-Masterblanding indeholdende 1.Verso 1-Step RT-PCR-Masterblanding (Thermo Scientific), 1. Verso-en .ymblanding (Thermo Scientific), 0.,5 µg /LL BSA, 100 cycg / mL cyclohe .imid, og primere til revers transkription og HC og LC samling (0,8 µM hver af primere TitA_MID1_IgM_rev og TitB_MID12_IgK_rev; 0,16 µM hver af primere Oe_mhv_f .d og Oe_mkv_f .d). Primer sekvenser er vist i flere filer 1: Figur S1a. Den resulterende 200 µL vandig opløsning, der blev brugt til at danne en vand-i-olie-emulsion ved dråbevis ud (13 alikvoter af 15 µL i 30-s mellemrum) til 800 µL olie fase i henhold til Ge et al. (Mineralolie, Sigma M5904, med 4,5% Span 80, Sigma S6760, 0,4% T .een 80, Sigma P8074 og 0.,05% Triton 100-100, Sigma T8787) under kontinuerlig omrøring på en magnetisk omrører., Seks portioner af 100 µL for hver af de resulterende emulsion blev overført til PCR-rør og udsat for thermocycling med følgende betingelser: reverse transkription ved 50 °C i 15 min, RTase inaktivering ved 95 °C i 2 min., derefter fire serier af denaturering ved 95 °C i 20 s, udglødning rampdown fra 60 °C til 50 °C til 50 s og udvidelse ved 72 °C i 1 min, derefter 16 cykler af denaturering ved 95 °C i 20 s, annealing ved 60 °C til 30 s og udvidelse ved 72 °C i 1 min, efterfulgt af en endelig udvidelse trin ved 72 °C i 5 min., Parallelt blev en åben RT-PCR-kontrol udført ved fortynding af 4 µL resuspenderede mikrosomer i 46 µL RT-PCR-Masterblanding og termocycling af reaktionen parallelt med emulsionen RT-PCR. PCR-samlingsprodukter blev ekstraheret fra emulsionen under anvendelse af isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) og DNAYMO DNA Clean & Concentrator-5 kit (.ymo Research) som tidligere offentliggjort . Det resulterende DNA og PCR-produktet fra den åbne PCR-kontrol blev indlæst på en 1,2% TBE-agarosegel og adskilt med 90 V i 60 minutter., Samlingsprodukter af 800-950 bp-størrelse blev størrelsesvalgt fra agarosegelen, og produkterne blev genvundet ved hjælp af et DNAYMOCLEAN Gel DNA Recovery kit. Samlingsprodukter blev elueret i 6 mM Tris-cl pH 8 og opbevaret ved-20.C indtil yderligere analyse.,
indlejret PCR-amplifikation af musehybridoma-samlingsprodukter
efter emulsionssamlingsreaktionen blev samlingsprodukterne yderligere forstærket med Adapterprimere Tita_f ,d, 5′ CGT ATC GCC TCC CTC GCG CCA TCA g 3′, og TitB_rev, 5′ CTA TGC GCC TTG CCA GCC CGC TCA g 3′ ved anvendelse af Phusion high-fidelity DNA polymerase kit (Finn ,ymes) med efter termocyklingsbetingelser: indledende denaturering ved 98.C i 30 S, derefter 15 denatureringscyklusser ved 98. C i 7 s og udglødning/forlængelse ved 72. C i 30 s, efterfulgt af et sidste Forlængelsestrin ved 72. C i 5 minutter., PCR-produkter blev renset med DNAYMO DNA Clean & Concentrator-5 kit. Parringen af HC og LC i samlingsprodukterne blev derefter analyseret ved PCR under anvendelse af indlejrede primere specifikke for de tre forskellige HC og tre forskellige LC (yderligere fil 1: Figur S1e) under anvendelse af Phusion high-fidelity DNA polymerase kit med følgende termocycling betingelser: initial denaturering ved 98.C i 30 s, derefter 24 cyklusser af denaturering ved 98. C i 7 s og annealing/forlængelse ved 72. C i 30 s, efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 72. C i 5 min., Indlejrede PCR-produkter blev indlæst på en 1,2% TBE-agarosegel og adskilt med 90 V i 40 minutter. Real-time indlejret PCR til kvantificering af krydskontaminering blev udført i tre eksemplarer med de samme indlejrede primere under anvendelse af SYBRGreen master mi. (Applied Biosystems) på en Steponeppcr cycler (Applied Biosystems) med følgende termocyklingsbetingelser: initial denaturering ved 95. C i 10 minutter, efterfulgt af 40 denatureringscyklusser ved 95. C i 15 s, annealing ved 56. C i 30 s og forlængelse ved 72. C i 45 s., De oprindelige forekomster af de forstærkede samlingsprodukter blev beregnet ved hjælp af 2^(-deltaCt) – metoden og afbildet som søjlediagrammer med fejlbjælker, der viser standardafvigelse fra middelværdien.
immunisering og CD19+ B-celleisolering fra perifere helblodprøver
de humane perifere helblodprøver, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra in.vent Diagnostica GmbH som biprodukter fra rutinemæssige diagnostiske procedurer. i.,vent Diagnostica GmbH har skriftligt informeret samtykke fra donoren til at bruge biprodukterne til forskning og har en etisk godkendelse fra Freiburg Ethics Commission International (FEKI code 011/1763) til distribution af prøver. En sund proband gennemgik en booster vaccination med Tetanus Toxoid (TT)/Diptheria Toxoid (DT) (Td-pur®; 20 Internationale enheder TT og 2 IU DT; Novartis, Basel, Schweiz)., K2-EDTA perifert fuldblod afledt af præ-immunisering (dag 0) og syv dage efter TD-booster-immunisering blev brugt til at isolere CD19+ B-celler ved hjælp af CD19 pluriBead-Celleseparationssæt (pleriselect GmbH, Leip .ig, Tyskland) efter producentens protokol. Isolerede CD19 + B-cellepellets blev vasket i 1 mL kold PBS og centrifugeret ved 300 g i 10 minutter ved 4 C. C. Cellepellets svarende til 1,5 millioner b – celler fra både præ-og post-immuniseringsprøver blev holdt på is indtil cyclohe .imidbehandling og mikrosompræparation.,
Emulsion RT-PCR-samling under anvendelse af humane B – cellemikrosomer
Vi tilsatte 2 µL fortyndede mikrosomer fremstillet ud fra frosne ARH-77-celler (som intern parringskontrol) til 26 µL resuspenderede mikrosomer fra B-celler både præ-og post-TD-immunisering, så den endelige fraktion af ARH-77-mikrosomer er 0, 5% (v / v). Vi fortyndede 16 µL af denne mikrosomes suspension i 184 µL RT-PCR Masterblanding indeholdende 1.dart 1-step RT-PCR masterbufferblanding (Roboklon), 2. dart masteren .ymblanding (Roboklon), 0.,5 µg/µL BSA, 100 µg/mL cycloheximide og primere til reverse transkription (IgM, IgG, og IgK) og tung (VH) og let kæde (VK) forsamling. Primer sekvenser og koncentrationer i RT-PCR master Mi.er anført i yderligere fil 1: tabel s2., Den resulterende 200 µL vandig opløsning, der blev brugt til at danne en vand-i-olie-emulsion ved dråbevis ud (13 alikvoter af 15 µL i 30 sek intervaller) til 800 µL olie fase består af 73% emulsion komponent 1, 7% emulsion komponent 2, og 20% emulsion komponent 3 af Micellula DNA-emulsion og rensning kit (Roboklon) under løbende omrøring på en magnetomrører., Seks portioner på 100 µL hver af den resulterende emulsion blev overført til PCR-rør og underkastet termocycling under følgende betingelser: revers transkription ved 55 C C i 30 minutter, initial denaturering ved 95 C C i 3 minutter, derefter tre denatureringscyklusser ved 95L C i 20 s, annealing ved 56 and C i 30 s og forlængelse ved 72, C i 2 minutter, derefter 20 denatureringscyklusser ved 95, C i 20 s, annealing ved 56 and C i 30 s og forlængelse ved 72 and C i 4 minutter, efterfulgt af en endelig forlængelse trin ved 72 C C i 5 min., PCR-samlingsprodukter blev ekstraheret fra emulsionen under anvendelse af isobutanol (2-Methyl-1-propanol, Sigma) og DNAYMO DNA Clean & Concentrator-5 kit (.ymo Research) som tidligere offentliggjort . De resulterende DNA ‘ er blev indlæst på en 1% TBE-agarosegel og adskilt med 100 V i 45 minutter. Samlingsprodukter af 700-800 bp blev størrelsesvalgt fra agarosegelen, genvundet ved hjælp af et DNAYMOCLEAN Gel DNA Recovery kit, elueret i 6 mM Tris-cl pH 8 og opbevaret ved − 20.C indtil yderligere analyse.,
indlejret PCR-amplifikation af humane B-cellemonteringsprodukter
til specifik yderligere amplifikation af HC-LC-samlingsprodukterne blev der udført en indlejret PCR-amplifikation med indlejrede primere, der var specifikke for IgM -, IgG-og IGK-konstante regioner (yderligere fil 1: tabel s2). PCR-reaktionen indeholdt indlejrede primere ved 0,4 µM koncentrationer, 200 µM dNTP-blanding, 1 reaction55-reaktionsbuffer og 0,02 U /ll55 high-fidelity DNA-Polymerase (ne.England Biolabs) i et reaktionsvolumen på 50 µL med 3 µL samlet DNA., Indlejret PCR-amplifikation blev udført under følgende termocyklingsbetingelser: initial denaturering ved 98.C i 3 minutter, derefter 34 cyklusser med denaturering ved 98. C i 30 s og udglødning/forlængelse ved 71. C i 1 min, efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 72. C i 5 min. Prøver blev indsamlet efter tre forskellige PCR-cyklusnumre (28, 31 og 34 cyklusser). Amplificerede PCR-produkter blev indlæst på 1% TBE-agarosegeler og adskilt med 100 V i 60 minutter., De ønskede produkter af ~ 710 bp blev ekstraheret som beskrevet ovenfor, sekventeringsbiblioteker blev udarbejdet efter Illumina Truse.DNA sample preparation guide og 2 250 250 base parret ende læser blev sekventeret ved hjælp af Illumina mise. platformen.
Bioinformatisk analyse af parret antistof tunge og lette kæderepertoirer
Demultiple .ing af 2 250 250 baseparret-end læser fra mise. – sekventeringsplatformen blev udført baseret på adapterindekser, og sekventeringsdata blev opnået i fast. – format., Læser kun med minimum Phred kvalitetsresultater på 10 over 50% af alle nukleotider blev tilbageholdt og scannet for IgM, IgG, og IgK konstant region sekvenser. Læs par mangler konstant region sekvenser eller viser HC – HC eller LC-LC struktur blev filtreret ud og de resterende læser blev omdannet til fast.format og anvendes som input til analyse med Mi .cr (V1.2) til justering af læser til reference V(D)J og C gensekvenser fra IMGT-databasen , ekstraktion, og clustering af CDR-H3 nukleotid (yderligere fil 1: tabel S1)., HC-CDR3-sekvenser indeholdende rammeskift eller stopkodoner og med mindre end to læsninger blev filtreret ud. Vi oprettede en HC-LC-parringsstatistik-fil for at demonstrere parret VH-VK-genbrug i de samlede parrede HC-LC-genrepertoirer. Varmekort blev genereret ved hjælp af R og grafisk vist ved hjælp af ggplot2. Dernæst blev inter-individuelle TT-specifikke HC-CDR3-sekvenser identificeret ved at sammenligne HC-cdr3-aminosyresekvenser opnået fra Post-Td booster-immuniseringsprøven til tidligere rapporterede TT-specifikke HC-cdr3-sekvenser .,
PCR-amplifikation af HC-og LC-sekvenser i fuld længde
Vi designede en to-trins PCR-baseret amplifikationsmetode (yderligere fil 1: Figur S5) til at inkorporere restriktionsfordøjelsessteder til potentielt TT-specifik HC og LC med komplet V(D)J-gensekvens. Dette muliggjorde effektiv kloning af HC-og LC-sekvenser i respektive ekspressionsvektorer samt produktion af rekombinante antistoffer til in vitro-bindingsundersøgelser., Kort, vi valgte 14 parrede HC-LC CDR3-klonotyper opnået fra IgG-sekventering post-td booster-immunisering baseret på deres frekvens, parringsnøjagtighed, og fold forskel mellem top1 LC-CDR3 og top2 LC-cdr3 parret med den givne HC-cdr3-sekvens. Vi ekstraherede total RNA fra frosne B-celler isoleret fra Post-td booster-immunisering ved hjælp af Tri .olreagens (Ambion) oprensning i henhold til producentens anvisninger. I det første trin blev RT – PCR-amplifikation for hver valgt HC-og LC-CDR3-klonotype udført separat ved hjælp af dart 1-trins RT-PCR-kit (Roboklon)., RT-PCR master mix (25 µL) indeholdt HC-og LC-V-gene-specifikke frem primere med BssHII begrænsning stedet hænger sammen med de enkelte CDR3-specifikke omvendt primere med 18 nukleotider af FR4 region på 0,4 µM koncentrationer (Ekstra fil 1: Tabel S3 og Figur S5), 1× dART 1-trin RT-PCR master buffer mix, 1× dART mester enzym blanding, og 4,5 ng samlede RNA., Termocyklingsbetingelserne var som følger: revers transkription ved 55.C i 30 minutter, initial denaturering ved 95. C i 3 minutter, derefter 23 cyklusser med denaturering ved 95. C i 20 s, annealing ved 56. C i 30 s og forlængelse ved 72. C i 90 s, efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 72. C i 5 minutter. RT-PCR produkterne blev renset hjælp Agencourt AMPure XP – PCR kit oprensning (Beckman Coulter) efter fabrikantens anvisninger og elueres i 6 mM Tris-Cl pH 8,0., I det andet trin blev oprensede RT-PCR-produkter anvendt som skabelon til PCR-amplifikation ved anvendelse af55 high-fidelity DNA-polymerase (ne.England Biolabs). Den nested PCR master mix (50 µL) indeholdt frem primere kodning en BssHII begrænsning site og tre nukleotider af HC eller LC germline-gen-sekvens sammen med reverse primere, der indeholder den komplette FR4-regionen og NheI/HindIII begrænsning udhæng på 0,4-µM-koncentrationer (Ekstra fil 1: Tabel S3 og Figur S5), 4 µL af oprenset DNA, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reaction buffer, og 0.,02 U / µl55 high-fidelity DNA Polymerase (ne.England Biolabs). Thermocycling forholdene var som følger: indledende denaturering på 98 °C i 3 minutter, derefter 16 cykler af denaturering på 98 °C til 30 s, udglødning på 69 °C til 30 s og udvidelse ved 72 °C i 1 min, efterfulgt af en endelig udvidelse trin ved 72 °C i 5 min. PCR-produkter blev adskilt på en TBE-agarosegel, HC-og LC − amplikoner i fuld længde med begrænsningsfordøjelsessteder blev ekstraheret fra gelen ved anvendelse af DNAYMOCLEAN Gel DNA Recovery Kit (.ymo Research), og produkter blev opbevaret ved-20.C indtil videre brug.,
kloning og ekspression af rekombinante monoklonale antistoffer
Restriktionsfordøjelse af fuld længde HC-og LC-indsatser og ekspressionsvektorer (pcmv-CD30-4IE3_HC og pcmv-CD30-4IE3_LC) blev udført med restriktionsen .ymerne BssHII, NheI og HindIII (ne.England Biolabs). De resulterende produkter blev indlæst på 2% TBE-agarosegeler og bånd på ~ 5, 9 kb for HC vector backbone, 5, 3 kb for LC vector backbone, ~ 370 bp for HC-indsatser og ~ 340 bp for LC-indsatser blev størrelsesvalgt på agarosegeler og renset som beskrevet ovenfor., Ligationer af de tilsvarende indsatser og vektorer til de forstærkede HC-og LC-klonotyper blev udført ved anvendelse af øjeblikkelig klæbrig-end DNA-ligase (ne.England Biolabs) og omdannet til kemisk kompetente E. coli TOP10-celler med et skud (IBA) efter producentens anvisninger. Plasmid DNA ‘ er blev isoleret fra transformerede kolonier (8-16 kolonier) under anvendelse af miniaprep spin miniprep kit (.iagen); ligheder med konsensussekvenserne blev bekræftet ved anvendelse af kapillær Sanger sekventering., HC-og LC-plasmid-DNA-sekvenser, der matchede tættest på konsensussekvenserne, blev co-transficeret til humane embryonale nyrecellelinje HEK 293 t (ATCC, CRL-11268) celler. HEK 293 T-celler blev dyrket ved anvendelse af rig glucose (4.5 g/L D-glucose) Dulbeccos modificerede Eagles Medium (Gibco BRL) suppleret med varmeinaktiveret ultra-lavt IgG føtal bovint serum (Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Oprensede plasmid DNA ‘ er for parrede HC-og LC-klonotyper blev co-transficeret til 85-95% sammenflydende HEK 293 T-celler under anvendelse af PEI (polyethyleneamin, Polysciences)., Kultur supernatanter blev opsamlet fire dage efter transfektion og TT antigen-specifikke clonotyper blev identificeret ved indirekte ELISA.
en .ymbundne immunosorbentassays (ELISA)
Vi udførte indirekte ELISA-assays for at identificere mAbs afledt af den immuniserede probandbinding til TT-antigen under anvendelse af de transficerede cellekultur supernatanter. Nunc-Immuno MicroWell 96-brønds solide plader (Thermo Fisher Scientific) var belagt med 100 ĩl af 10 mg/mL TT-antigen (Statens Serum Institut, København, Danmark) i 50 mM-carbonat-buffer, pH 9.,6, inkuberet natten over ved 4 C C, vasket tre gange med PBS og blokeret med 2% fedtfri tørret mælk (Bio-Rad) i PBS i 150 minutter ved stuetemperatur. Efter en blokering, 120 µL 1:2 serielt fortyndet transfected supernatanterne i HM (PBS og 0,1% Tween-20, 2% non-fat tørret mælk) blev tilsat til microwells, 350 ng af musen anti-TT mAb (GeneTex) blev anvendt til en brønd som en positiv kontrol, og blev pladerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Pladerne blev vasket tre gange med PBS-t (0.,1% T 20een-20) og 50 µL af en 1:2000 fortynding af ged anti-human kappa LC-HRP sekundært antistof (Thermo Fisher Scientific) blev tilsat til brøndene, 50 µL af en 1:2000 fortynding af ged anti-mus IgG HC-HRP sekundært antistof (Sigma #A0168) blev tilsat til den positive kontrolbrønd, plader blev inkuberet i 2 minutter ved stuetemperatur og vasket tre gange med PBS-T. til farveudvikling tilføjede vi 50 µL Et-trins Ultra TMB-ELISA substrat (Thermo Fisher Scientific) pr brønd, inkuberet pladerne i 5 minutter ved stuetemperatur, og stoppede AG:AB bindingsreaktionen ved tilsætning af 50 PI 2 m H2SO4., Absorbansen blev målt ved 450 nm ved hjælp af Gloma.Multi Detection System (Promega). ELISA-assays for alle klonotyper blev udført i tre eksemplarer, værdierne blev normaliseret for at fjerne baggrundssignaler, og fejl blev repræsenteret som standardafvigelser fra gennemsnittet.
analyse af kimær amplicondannelse under indlejret PCR
fire definerede HC-LC ampliconer blev genereret ved at forstærke HC og LC fra de respektive pCMV plasmider (se ovenfor) og ved anvendelse af en PCR-samlingsreaktion til generering af de fire forskellige HC-LC-samlinger., HC-og LC-plasmid dna ‘ er blev brugt som skabeloner til PCR-amplifikation af Top1, Top2, Top3, og Top4 en kæde par ved hjælp af primere, der er specifikke for den pågældende VH og VK-genet familier og IgG og IgK konstant regioner (Ekstra fil 1: Tabel S2 og Figur S6a). Oprenset plasmid DNA (10 ng) blev føjet til hver 25 µL PCR reaktion, der indeholder på 0,4 µM af hver primer, 200 µM dNTP mix, 1× Q5 reaction buffer, og 0.2 U/µL Q5 high-fidelity DNA-Polymerase., Termisk cykling blev udført med initial denaturering ved 98.C i 3 min, efterfulgt af 25 cyklusser med denaturering ved 98. C i 30 s, udglødning/forlængelse ved 71. C i 1 min (for HC plasmid DNA) eller udglødning ved 64. C i 1 min og forlængelse ved 72. C i 1 min (for LC plasmid DNA), efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 72. C i 5 min. PCR-produkter blev lastet på separate 1% TBE-agarosegeler og adskilt med 100 V i 60 minutter. De ønskede DNA-produkter på ~ 400 bp (for HC) og ~ 350 bp (for LC) blev størrelsesvalgt og ekstraheret fra gelen som beskrevet ovenfor., De oprensede HC og LC PCR produkter blev anvendt som skabeloner til HC og LC samling ved overlap e .tension PCR (yderligere fil 1: Figur S6b). Kort fortalt blev 5 ng af hver HC og tilsvarende parret LC-DNA tilsat til hver 50 µL PCR-reaktion indeholdende 1 dART dart 1-trins RT-PCR-masterbuffer (Roboklon), 2.dart-masteren .ym (Roboklon) og 0,4 µM af hver IgG-og IgK-konstantregionsprimer (yderligere fil 1: tabel s2)., Termisk cykling blev udført med RT-inaktivering ved 95 °C i 3 min, efterfulgt af tre cyklusser af denaturering ved 95 °C i 20 s, udglødning ved 56 °C til 30 s og udvidelse ved 72 °C i 2 min., efterfulgt af 25 cyklusser af denaturering ved 95 °C i 20 s, udglødning ved 56 °C til 30 s og udvidelse ved 72 °C i 4 min, efterfulgt af en endelig udvidelse trin ved 72 °C i 5 min. Samlingsprodukterne blev lastet på 1% TBE-agarosegeler og adskilt med 100 V i 45 minutter. Samlingsprodukterne på ~ 750 bp blev størrelsesvalgt og ekstraheret fra agarosegelen som beskrevet ovenfor., De individuelt monterede HC-LC klonale par blev samlet sammen og brugt som skabelon til indlejret PCR amplifikation med primere specifikke for IgG og IgK konstante regioner (yderligere fil 1: tabel S2, figur S6c). Den indlejrede PCR-reaktion og termiske cyklingsbetingelser var de samme som beskrevet i afsnittet “indlejret PCR-amplifikation af humane B-cellemonteringsprodukter” bortset fra at PCR-amplifikationen blev udført i 25 cyklusser. PCR-produkter blev lastet på 1% TBE-agarosegeler, adskilt med 100 V i 60 minutter, og ønskede produkter på ~ 720 bp blev ekstraheret som beskrevet ovenfor., Sekventeringsbiblioteker fra de enkelte samlinger og fra de blandede samlinger efter indlejret PCR blev udarbejdet efter Illumina Truse.DNA-prøveforberedelsesguide og 2 250 250 baseparrede-end-læsninger blev genereret ved hjælp af Illumina mise. – platformen.