GLP-1 OG INSULIN SEKRETION
Oversigt over ATP-følsomme vej.
Glukosestimuleret insulinsekretion (GSIS) reguleres af et antal ioniske og ikke-ioniske signalveje, også kendt som de KATP-afhængige og-uafhængige veje (34,35). Den KATP-afhængige mekanisme for stimulus-sekretionskobling gennemgås i Fig. 1., Generelt tilpasser β-cellen insulinsekretion til gældende blodglukoseniveauer gennem glukosemetabolisme. Når glukoseniveauerne stiger, øges glycolysehastigheden, hvilket genererer substrater (hovedsageligt pyruvat) til mitokondriel o .idativ metabolisme, hvoraf resultatet er dannelsen af ATP eller mere korrekt en stigning i ATP-til-ADP-forholdet (36). Denne begivenhed giver den funktionelle forbindelse mellem en glukosestimulus og insulinsekretion., Forøgelsen i dette forhold forårsager lukning af kat-celle KATP-kanaler, hvilket fører til plasmamembran depolarisering, aktivering af spændingsafhængige Ca2+-kanaler (VDCCs) og en stigning i den intracellulære koncentration af Ca2+ (i), den vigtigste trigger til insulinsekretion. Repolarization af β-celler er sandsynligvis medieret af spænding-afhængige K+ (Kv) kanaler og Ca2+-følsomme spænding-afhængige K+ (KCa) kanaler (37), som åbner i reaktion på glukose-inducerede membran depolarisering til at genoprette den udadgående strøm af K+., GLP-1 foreslås at modulere GSI ‘ er ved at regulere aktiviteten af flere ionkanaler involveret i KATP-afhængig insulinsekretion samt trin distal til kanalmodulering.
GLP-1 Og β-celle KATP kanaler.
en af de mange observerede cellulære virkninger af GLP-1 er inhiberingen af kat-celle KATP-kanaler (38-40). Den resulterende membran depolarisering induceret af KATP kanallukning initierer Ca2+ tilstrømning gennem VDCCs og udløser den e .ocytotiske frigivelse af insulin., Figur 2 viser excitatorisk effekt af GLP-1 på membran potentiale og dens hæmmende effekt på både indfødte KATP kanal strøm fra INS-1 celler og strømninger medieret af rekombinant KATP-kanaler (SUR1/Kir6.2) coexpressed med GLP-1 receptor i en animalsk celle linje. De fysiologiske konsekvenser af GLP-1-faciliteret KATP – kanallukning ville være at 1) øge e .citabiliteten af celler allerede over tærsklen for insulinfrigivelse og 2) øge procentdelen af β-celler, der aktivt udskiller insulin ved glukosekoncentrationer, normalt undertryk for frigivelse af insulin.,
konsensussynspunktet er, at den hæmmende virkning af GLP-1 på KATP-kanaler er cAMP / PKA-afhængig (38-41), skønt en undersøgelse, der bruger rotte-β-celler, er uenig (42). Denne påstand af Suga et al. (42) er baseret på deres konstatering af, at den specifikke PKA-hæmmer Rp-cAMPS (100 µmol/l) ikke var i stand til at forhindre den cellulære depolarisering og reduktion i KATP-strømmen med hele celler fremkaldt af GLP-1. Fuldstændigheden af PKA-hæmning af Rp-lejre bør stilles spørgsmålstegn ved, fordi forskolin i samme undersøgelse inducerede signifikant insulinsekretion, selv i nærværelse af Rp-lejre. For det andet Suga et al., foreslå, at GLP-1 forårsager en lille stigning i ATP-følsomheden af KATP-kanalen, således at KATP-kanalen ved lave mikromolære ATP-koncentrationer vil være mere modtagelig for lukning. I den normale rottepancreatiske β-celle er millimolære niveauer af ATP imidlertid til stede (43), og ved disse fysiologiske ATP-niveauer forudsiges meget lignende KATP-kanal åben Sandsynlighed (Po) i fravær og tilstedeværelse af GLP-1 som følger. Vores beregninger viser, at med en intracellulær på 2 mmol/l reduceres KATP-kanalen Po fra 0,005 til 0,003 i nærvær af GLP-1., Det er plausibelt, at et venstreskift af ATP-følsomhed forekommer i nærvær af GLP-1. Imidlertid er den observerede størrelse af GLP-1-induceret KATP strømreduktion set i hele celle patch-clamp optagelser (fig. 2) er sandsynligvis for stor til kun at blive redegjort for de små fald i Po beregnet ud fra dataene fra Suga et al. (42). Nyligt arbejde fra vores laboratorium har vist, at den membranpermeante specifikke PKA-hæmmer H-89 (44) er i stand til fuldstændigt at hæmme KATP-strømreduktion med GLP-1 (45)., Desuden har andre vist lignende resultater ved hjælp af Rp-8-br-lejre, en mere membrangennemtrængelig analog af Rp-lejre (38,41). De handlinger, en GLP-1 på KATP-kanaler kan også inddrage andre signalveje, fordi KATP kanal hæmning af GLP-1 i mus β-celler blev påvist at være calmodulin afhængig, hjælp calmodulin-hæmmere W-7 og calmidazolium (46).
glukoseafhængigheden af GLP-1-handlinger er veletableret, selvom de præcise mekanismer for denne afhængighed er uklare (41,47)., Imidlertid kan de cellulære handlinger af PKA på KATP-kanalen tilvejebringe en forbindelse mellem denne kinase og glucosefølsomheden af GLP-1. Andre grupper har vist, at tilsætning af den katalytiske underenhed af PKA (cPKA) til udskårne patches indeholdende KATP-kanaler resulterer i en forøgelse af KATP-strømmen (39,48). Vores laboratorium har for nylig vist, at effekten af cPKA på KATP current er afhængig af ADP (45). Når ADP-niveauer er forhøjet, øger cPKA KATP-kanalstrømmen i et rekombinant system, i overensstemmelse med resultaterne af Lin et al. (39)., Omvendt, når ADP-niveauerne falder, reducerer cPKA KATP-strømmen (45). Fysiologisk, kan dette medføre en ubetydelig forbedring af β-celle ophidselse, når blodsukkeret er lavt (højt ), der henviser til, når blodsukkerniveauet stiger (lav ), GLP-1-medieret lukning af KATP-kanaler, via en PKA-afhængig vej, fører til membran-depolarisering, og efterfølgende stigninger i β-cellen ophidselse., Der skal lægges særlig vægt på det cellulære ATP-til-ADP-forhold, når man overvejer KATP-kanalaktivitet, fordi det er ændringer i dette forhold, mere end blot ændringer i intracellulær i sig selv, der styrer aktiviteten af KATP-kanaler i den intakte β-celle. Fri ATP er stærkt bufret i cellen af membran og cytosoliske atpaser (43) og forventes ikke at ændre sig signifikant med øget glukosemetabolisme (36). I modsætning hertil er den gensidige ændring i ADP, som ikke er bufferet i samme omfang, mere signifikant og resulterer i en ændring i ATP-til-ADP-forholdet (36)., Faktisk er ADP ‘ s betydning for kontrol af KATP-kanalaktivitet i β-celle blevet påvist, fordi mutationer i ADP-sensing-regionen i den humane KATP-kanal fører til ukontrolleret insulinsekretion og hypoglykæmi (49). Den molekylære identitet af PKA phosphoryleringssted (er) er af væsentlig betydning og er stadig under undersøgelse. Begge Kir6.,2 og SUR1 underenheder af KATP-kanalen indeholder formodede målsekvenser for PKA-medieret phosphorylering (39,48), og systematisk mutation af disse rester bør afklare de relative bidrag fra disse steder til virkningen af PKA på KATP-kanalen.
GLP-1, VDCCs og intracellulære Ca2+ butikker.
GLP-1 har vist sig at forbedre strømme gennem Vdcc ‘ er i mus, rotte og humane β-celler (38,50–52), selvom størrelsen af denne effekt varierer og ofte ikke når statistisk signifikans., I enkelt menneske β-celler, GLP-1 har vist sig at øge L-type VDCC aktivitet og amplituden af depolarisering-fremkaldt intracellulære calcium transienter, en effekt, der tegnede sig for 40% af stigningen i GLP-1-forstærkede exocytosis (52). Selvom L-type VDCCs Klassisk betragtes som de vigtigste regulatorer af Ca2+-tilstrømning, der fører til insulinsekretion, er β-celler kendt for at udtrykke flere Ca2+ – kanalisoformer (53). Perever etev et al. (54) rapporterede for nylig, at mus, der mangler A1E-isoformen af Cav2.3, har reduceret glukosetolerance og formindsket insulinrespons på glucose., De spekulerer i, at g-proteinregulering af denne kanal kan modulere insulinsekretion baseret på muscarinisk acetylcholinreceptorregulering af VDCCs in vitro (55).
Vi har fundet i HIT-T15 insulinomceller, der er transficeret med GLP-1-receptoren, at GLP-1 forårsager en stigning i spændingsafhængige Ca2+ strømme (se 56 og fig. 3A). Dette skyldes i det mindste delvist et venstreskift i spændingsafhængigheden af aktivering, der minder om effekten af VDCC-phosphorylering af PKA (57,58)., Vi observerede også et højre skift i spændingsafhængigheden af steady-state inaktivering, således at i nærvær af GLP-1 blev mindre kanaler effektivt inaktiveret ved et givet holdepotentiale (50). Dette understøttes af Britsch et al. (50), der antyder, at GLP-1-behandling af mus-β-celler bremser inaktiveringen af spændingsafhængige Ca2+ – strømme. Derudover førte GLP-1 til en stigning i intracellulært calcium først efter glukosetilsætning, en effekt, der delvis blev blokeret af VDCC-antagonister (fig. 3C)., GLP-1 ‘ s evne til at forbedre Ca2+-strømme er, ligesom effekten på KATP-kanaler, cAMP-afhængig (51,52), baseret på Rp-Lejrs evne til at forhindre en stigning i Strømme. Faktisk replikerede behandling af rotte-β-celler med dibutyrylcyklisk AMP, en membranpermeabel cAMP-analog, effekten af GLP-1 på Ca2 + strømme (51)., Derudover blev vdcc-responsen på GLP-1 i vores undersøgelser (56) tabt i HIT-T15-celler, der udtrykte en mutant GLP-1-receptor, der manglede kritiske rester, der kræves til kobling til adenylylcyklase, hvorimod VDCC-aktivitet stadig kunne forbedres af cAMP-uafhængig agonist BAYK8644. Nylige beviser tyder på, at et a-kinase-forankringsprotein (AKAP), AKAP18, målretter PKA mod Vdcc ‘ er, og at denne kinase kan være involveret i GLP-1-modulering af disse kanaler (59).,
ud over effekter på Vdcc ‘ er kan GLP-1 mobilisere intracellulære calciumlagre på en cAMP-afhængig måde (60,61), hvilket muligvis bidrager til det oscillerende i-respons på GLP-1 set i HIT-T15-celler (fig. 3C) (62). Vores undersøgelser antyder, at GLP-1-applikation resulterer i svingninger i I I HIT-T15-celler, og at disse svingninger ikke afskaffes (selvom de er formindsket i amplitude) ved fjernelse af ekstracellulær Ca2+ eller ved VDCC-blokade (fig. 3C)., I en række celletyper er Ca2+-oscillationer induceret af en agonist primært forårsaget af Ca2+ – frigivelse gennem inositoltrisphosphat (IP3) og/eller ryanodinfølsomme lagre (63-65). I β-celler mobiliserer GLP-1 Ca2 + – butikker i vid udstrækning ved at sensibilisere ryanodinreceptoren (sandsynligvis type 2 isoform, RYR-2) til processen med Ca2+-induceret Ca2+ – frigivelse (CICR) (61,66). Flere undersøgelser har vist, at GLP-1 kan øge i på en PKA-uafhængig måde (67-69)., Denne mekanisme er for nylig blevet tilskrevet CICR fra ryanodinfølsomme lagre via cAMP-reguleret guanin-nukleotidudvekslingsfaktor II (GEF-II eller Epac2) og dens interaktion med enten det Ras-relaterede lille g-protein Rap1 eller med Rab3 lille g-protein effektor Rim2 (68). Betydningen af cAMP-GEF-II-Rim2 er blevet påvist, fordi inaktivering af denne komplekse (ved antisense oligonukleotider eller mutant konstruktioner) svækkede den sekretoriske svar på musen holme eller MIN6 insulinoma celler til at GLP-1 (67)., Fordi affiniteten af cAMP for PKA er meget højere (∼100 nmol/l) sammenlignet med cAMP-GEF-II (10 10 mmol/l), er det interessant at spekulere i, at den GLP-1-stimulerede cAMP-GEF-II-vej muligvis fungerer på en stigning i den lokale lejr snarere end globale ændringer., Selv om GLP-1 receptor signalering stimulerer IP3 produktion i GLP-1 receptor-udtrykke COS-celler (70), en rolle for IP3-følsomme Ca2+ – butikker i global-jeg er i tvivl på grund af GLP-1-stimuleret IP3 produktion i den primære β-celler er efter sigende minimal (71,72) og IP3 receptor antagonist xestospongin C undladt at blokere frigivelse af intracellulære Ca2+ – butikker af forskolin behandling (68). IP3-reguleret Ca2 + – frigivelse fra insulingranuler er imidlertid blevet foreslået af undersøgelserne af Nakagaki et al., (62), suggestho foreslår, at GLP-1 unikt kan regulere tidsmæssig og rumlig frigivelse af intracellulært calcium gennem lokal IP3-signalering. Således bidrager GLP-1-medieret frigivelse af intracellulære butikker sammen med potentiering af Ca2+-indgang gennem Vdcc ‘ er sandsynligvis til den insulinotropiske virkning af GLP-1.
GLP-1 Og β-celle Kv kanaler.
spændingsafhængige k+-strømme, såsom dem, der medieres af Kv-eller KCa-kanaler, medierer repolarisering af β-celler efter en depolariserende stimulus, såsom glucose (37)., For nylig rapporterede vi, at Kv1-og Kv2-familiekanaler regulerer insulinsekretion, fordi dominerende-negativ funktionel knockout af en af disse kanalfamilier forbedrede GSIS (73). Kv2.1-kanaler mægle størstedelen af denne effekt (>60%), den mekanisme, som indebærer øget glucose-stimuleret membran depolarisering og Ca2+ post (upubliceret observationer). Fordi β-celle Kv-strømme er potente glukoseafhængige regulatorer af insulinsekretion, antog vi, at fysiologiske sekretagoger, såsom GLP-1, kan regulere kV-kanalfunktion., Faktisk rapporterer vi andre steder i dette supplement, at GLP-1-receptoragonisten e .endin 4 hæmmer spændingsafhængige udadgående k+ strømme i rotte β-celler spænding-fastspændt i hele cellekonfigurationen med 40% og forlænger signifikant tidsforløbet for β-celle repolarisering efter kortvarig depolarisering ved strøminjektion. Dette sammenlignes med en 86% reduktion i udadgående k+ – strømme opnået med den generelle Kv-kanalantagonist tetraethylammonium. GLP-1 antagoniserede spændingsafhængige udad k+ strømme i rotte β-celler i fravær af glucose., Imidlertid kan denne effekt stadig bidrage til glukoseafhængigheden af GLP-1s insulinotrope virkning, fordi Kv-kanaler normalt ikke forventes at være aktive før efter en glukoseinduceret depolarisering af cellemembranen (37). Derudover og i lighed med virkningen af GLP-1 på de andre ionkanaler, der er nævnt ovenfor, er e .endin 4-medieret hæmning af β-celle Kv-kanaler afhængig af cAMP-signalering. En nylig undersøgelse antydede imidlertid, at cAMP-signalering ikke var tilstrækkelig i sig selv til at modvirke spændingsafhængige K+-strømme i en insulinudskillende cellelinie (INS-1) (74).,
talrige undersøgelser har beskrevet virkninger af hormonmedierede ændringer i spændingsafhængige K+-strømme, både e .citatoriske og hæmmende. Den bedst karakteriserede af disse effekter er den spændingsafhængige K+ strøm nedregulering i lymfocytter og opregulering i hjertemyocytter (75,76). I begge disse væv er cAMP / PKA-signalvejen impliceret i reguleringen af disse kanaler (76,77)., Rapporter antyder, at cAMP kan reducere spændingsafhængige K+ – strømme i murine lymfocytter (76) og en hypofysecellelinie (78), men forbedre spændingsafhængige K+-strømme i hjertemyocytter (77), et fund, der er bekræftet på enkeltkanalniveauet i frog atriale myocytter (79) og den gigantiske blæksprutte a .on (80)., Phosphorylering kan forekomme direkte på kanalen, fordi PKA-phosphorylering af en atrial Kv-kanal nær NH2-terminalen forbedret kanalaktivitet (81), og phosphorylering af Kv1-kanal A-underenheder regulerer omfanget af inhibering af disse kanaler, der er tildelt af en regulatorisk β-underenhed (82). Phosphorylering af β-underenheder selv kan også modulere den regulatoriske interaktion med poredannende α-underenheder (83). Det er for nylig blevet påvist, at regulering af en hjerte-Kv-kanal (KVL .t) efter cAMP kræver ekspression af AKAP15/18 eller akap79 (84)., Derudover er en stigning i spændingsafhængig k+-strøm impliceret i epinephrin-induceret hæmning af den glukoseafhængige stigning i i i Ob/ob og +/+ mus-β-celler (85), da effekten blev vendt af tetraethylammonium. Interessant nok blev den hæmmende virkning af epinephrin på I også vendt af adenylylcyklaseaktivatoren forskolin (85). Derfor mener vi, at der er stigende bevis for, at hormonel modulering af Kv-strømme er fysiologisk vigtig. Specifikt forventes GLP-1-hæmning af disse strømme at føre til forbedret EXC-celle-e .citabilitet.,
GLP-1 og andre β-celle ionkanaler.
stigninger i intracellulær cAMP har længe været kendt for at forbedre Na+ – strømme (86), en effekt, der kan medieres gennem direkte kanalphosphorylering af PKA (87). Et forbigående Na + – strømrespons på cAMP blev først beskrevet i gastropodneuroner og betegnet INa(cAMP) (88)., I insulinsekretionsceller er RNA-ekspression af de ikke-selektive kationsgener mstrpc4 og LTRPC2 for nylig blevet påvist i henholdsvis insulinomaceller og humane holme (89), og cAMP er rapporteret at inducere genekspression af mNSC1, som koder for en muses ikke-specifik kationskanal (NSCC) (90). GLP-1 menes at forbedre en NSCC, der overvejende bærer Na + strømme (91,92). Denne effekt sker gennem GLP-1 ‘ s aktivering af cAMP signalering og frigivelse af intracellulære Ca2 + butikker og kan tjene som endnu en vigtig modulatorisk vej for GLP-1 i β-cellen (40)., Det er ikke klart, om de NSCC ‘ er, der aktiveres af GLP-1, svarer til den ikke-selektive kationsstrøm, der frembringes ved aktivering af Ca2+ – sensorreceptoren (93), men sidstnævnte virkning rapporteres ikke at involvere aktivering af GS-underenheden og kan derfor ikke involvere cAMP/PKA-vejen.
Der er lidt kendt med hensyn til virkningerne af GLP-1 på andre ionkanaler. Cell hævelse-aktiverede Cl-strømme er blevet påvist i insulin-secernerende celler (94), men en rolle for disse kanaler i insulinsekretion er uklar., Cl-kanaler, såsom cystisk fibrose transmembranledningsregulator og udadrettende Cl− kanaler aktiveres ved cAMP/PKA-signalering (95). Hvis der forekommer i β-cellen, vil denne virkning have en tendens til at fremme depolarisering. En rapport antyder, at GLP-1 aktiverer en Ca2+ – følsom Cl-strøm i oenopus-oocytter, der udtrykker GLP-1-receptoren(96), en effekt, der var afhængig af Ins (1,4,5)P3-afhængig intracellulær Ca2+ mobilisering (96). Det skal dog bestemmes, om GLP-1 kan stimulere Cl-strømme i insulinudskillende celler.
GLP-1 og eksocytose.,
Glucose kan udøve en stimulerende virkning på insulineksocytose uafhængigt af dets velkarakteriserede handlinger initieret ved hæmning af KATP-kanaler. Betydningen af denne vej kan til dels realiseres ved, at mus med en målrettet forstyrrelse i KATP (Kir 6.2 eller SUR1) ikke udviser åbenlyse abnormiteter i glukosetolerance (97,98). KATP-uafhængig insulinsekretion er ikke godt forstået og menes at involvere flere signaler, der virker på ikke-ioniske mål, især de distale trin af e .ocytose., Det er blevet foreslået, at glukosemetabolismen er nødvendig for denne stimulerende virkning, og at sandsynlige signaler inkluderer ATP, cAMP, glutamat og malonyl-CoA (rev. in 99 og 100). I betragtning af at ATP, cAMP og PKA alle er impliceret i den eksocytotiske proces, er det plausibelt at tro, at GLP-1 kan have virkninger distale for handlinger på ionkanaler, hvilket yderligere øger insulinsekretionen. Det er velkendt, at handlinger, der undertrykker GLP-1-induceret cAMP-akkumulering og PKA-aktivering, hæmmer insulinsekretion, hvilket antyder, at cAMP og/eller PKA er de plausible effektorer (101)., I mus-mouse-celler kan kun en brøkdel af e .ocytose forklares ved handlinger på stimulus-sekretionskobling (102). Fra undersøgelser, der viser, at cAMP inducerer sekretion i nærvær af lavt og højt i, foreslås det, at cAMP sensibiliserer det e .ocytotiske maskiner. Undersøgelser med fotoreleasable cAMP-og PKA-hæmmere viser, at cAMP fremkalder PKA-afhængige og uafhængige virkninger på e .ocytose. Stigninger i cAMP, uafhængigt af PKA-aktivering, synes at fremskynde e .ocytose af den let frigivelige pool i β-celler (103)., PKA-afhængig mobilisering af sekretoriske granuler synes i modsætning til selve dannelsen af cAMP at kræve glukosemetabolisme (øget ATP/ADP) og involverer translokation af granuler (103,104). En sådan virkning ville øge størrelsen af den let frigivelige pool, øge graden af genopfyldning af poolen og forbedre e .ocytose. Da GLP-1 kan øge både cAMP og PKA, kan effekter på e .ocytose antydes af disse data., Der er flere potentielle målproteiner til virkningerne af GLP-1, herunder β-celleopløselige N-ethylmaleimidfølsomme faktor vedhæftningsproteinreceptor (SNARE) proteiner (105).
GLP-1 og intracellulær energi homeostase.
nylige undersøgelser i klonale β-celler antyder, at de insulinotropiske virkninger af GLP-1 delvis medieres af en PKA-afhængig stimulering af hormonfølsom lipase (HSL) (106). Det foreslås, at lipolytiske virkninger af GLP-1 forårsager nedbrydning af trigycerider til frie fedtsyrer i β-celler, som derefter omdannes til langkædede CoA., En stigning i frie fedtsyrer kunne give substrat for mitokondrie-oxidation og ATP-produktion, hvilket fører til en større stigning i den intracellulære ATP til ADP-forhold og yderligere hæmning af KATP-kanaler. Derudover, fordi ATP selv kan påvirke e .ocytose, kan nogle af handlingerne af GLP-1 være at målrette de distale trin af e .ocytose, som nævnt ovenfor. Det har vist sig i flere undersøgelser, at ATP markant letter E .ocytose uafhængig af cellulær depolarisering, men er afhængig af Ca2+ (99)., Således kunne endnu en potentiel mekanisme forklare GLP-1-induceret insulinsekretion.