Hvad er PCR? – Begyndervejledningen

PCR er teknikken for moderne molekylærbiologiske laboratorier. Hvis du har brug for at kopiere, sekvensere eller kvantificere DNA , skal du kende PCR. Kort sagt er PCR (polymerasekædereaktion) en biokemisk teknik, der bruger termocycling og en .ymer til hurtigt og pålideligt at kopiere DNA, og det blev opfundet i en flash af inspiration af en videnskabsmand, der kørte på High .ay 128 fra San Francisco til Mendocino.,

denne artikel giver en kort, grundlæggende oversigt over PCR, med et par tip til at hjælpe dig med at undgå de mest almindelige faldgruber. Hvis du er ny, eller relativt ny til PCR, så er dette for dig. (Og selv hvis du er erfaren på PCR det er værd at læse for at opdatere, og måske få fat i et tip eller to!).

grundlæggende PCR-ingredienser:

Polymerase

polymeraser er en .ymer, der under de rette betingelser kan samle nye DNA-strenge fra template-DNA og nukleotider. Den oprindelige PCR-reaktion var besværlig, fordi de høje temperaturer, der var nødvendige for at denaturere DNA ‘ et, ville dræbe polymeraserne., Dette betød, at nye polymeraser efter hver opvarmningscyklus skulle tilføjes manuelt til reaktionen– en dyr indsats. I moderne PCR er dette imidlertid ikke et problem, da de polymeraser, der anvendes i moderne PCR, normalt kommer fra en af to termofile bakteriekilder, Thermus a .uaticus eller Pyrococcus furiosus. Disse polymeraser, henholdsvis Ta. (udtalt “tack”) og PFU (udtalt “P-F-U”) modstår let de høje temperaturer, der er forbundet med en PCR-reaktion., Kommercielle Ta and-og PFU-polymeraser er konstrueret til hastighed, troskab, processivitet (evne til at gennemføre lange læsninger) og deres evne til at læse GC-rige skabeloner. Virksomheder kommer konstant ud med nye polymeraser. Derfor skal du ikke nøjes med “hvad der er i din fryser”, men shoppe rundt efter den bedste kommercielle polymerase til dine PCR-behov. Tal også med din lokale salgsrepræsentant, da de ofte kan give gratis polymeraseprøver, så du kan bestemme, hvad der er bedst for dig.

Template DNA

Dette er det DNA, du designer dine primere til., Det er DNA ‘ et, som din polymerase vil læse og kopiere. Din skabelon DNA kan være genomisk, plasmid eller cDNA, men uanset hvad din kilde kvalitet tæller. Jo mere intakt og renere dit template-DNA er, desto lettere er det at få gode PCR-resultater. Husk også, at den ideelle mængde DNA afhænger af din kilde, normalt 1 pg-1 ng plasmid-DNA eller 1 ng-1 µg genomisk DNA pr.

primere

primere er korte fragmenter af syntetiseret DNA, der binder til din skabelon DNA. Du bliver nødt til at designe en “fremad” primer og en “omvendt” primer., Din for .ard primer betegner starten på din PCR. Denne primer sekvens er den samme som din 5-3 skabelon DNA sekvens. Din omvendte primer betegner slutningen af din PCR. Denne primers sekvens er det omvendte komplement af dit skabelon-DNA. Generelt er primere 18-22 basepar lange. Men vigtigere end deres længde er smeltetemperaturen på dine primere. Smeltetemperaturen på dine primere skal være 54-60.C og så ens som muligt som hinanden., Der er masser af online regnemaskiner, der kan beregne primer udglødning temperaturer, og de fleste virksomheder, der syntetiserer primere levere sådanne regnemaskiner.

nukleotider

som monomerer af DNA er nukleotider nødvendige til fremstilling af DNA-kopier. For de fleste DNA-PCR ‘er vil du bruge Deo .ynucleosid-triphosphater (dNTP’ er). Du kan købe disse separat eller som en dGTP, dCTP, dATP og dttp mi.. Uanset hvad du køber, skal du huske på, at nukleotider er meget følsomme over for fryse/optøningscykler. Derfor er det bedst at altid oprette små portioner af dine dntps., Sørg også for, at du opbevarer dem korrekt – brug ikke en frostfri fryser, der gennemgår automatiske afrimningscyklusser.

Buffer

de fleste kommercielle polymeraser leveres med deres ideelle buffer. Disse buffere leverer ikke kun den korrekte pH, men de har altid tilsætningsstoffer som magnesium, kalium eller DMSO, som hjælper med at optimere DNA-denaturering, renering og polymeraseaktivitet. Der vil være mere om disse tilsætningsstoffer i en kommende artikel.

Thermocycling:

det er her magien sker., Alle ovennævnte ingredienser tilsættes til et PCR-rør, og røret er termocycled. For at opnå termocykling, da PCR først blev opfundet, blev individuelle PCR-rør manuelt flyttet mellem opvarmede vandbade. (Og du synes, at dit bænkarbejde er kedeligt!) Takket være opfindelsen af “Mr. Cycles”, den første termocyclingmaskine, udføres temperaturregulering nu automatisk af termocyclers. Følgende er en typisk PCR-termocyclerprofil:

initialisering

i dette trin opvarmes reaktionen til 94-96.C i 30 sekunder til flere minutter., Dette trin udføres normalt kun en gang i begyndelsen af din PCR-reaktion. Dette trin er vigtigt for at aktivere hot-start polymeraser, hvis du bruger en sådan polymerase, og at denaturere din skabelon DNA. Husk, at hvis dit skabelon GC-indhold er højt, skal du muligvis udføre et ekstra langt initialiseringstrin.

denaturering (gentaget 15-40 gange)

i dette trin opvarmes reaktionen til 94-98.C i 15-30 sekunder. Dette trin denaturerer dit DNA og primere, som giver dem mulighed for at annealere til hinanden i det næste trin.,

udglødning (gentaget 15-40 gange)

i dette trin sænkes reaktionstemperaturen hurtigt til 50-64.C i 20-40 sekunder. Temperaturen i dette trin skal være lav nok til, at dine denaturerede primere kan danne baseatson-Crick basepar med din skabelon DNA. Men høj nok til, at kun de mest stabile (perfekt parrede) dobbeltstrengede DNA-strukturer kan danne sig. Normalt er denne perfekte udglødningstemperatur et par grader lavere end smeltetemperaturen for dit primerpar. Også i løbet af dette trin binder din polymerase til dit primer/skabelon DNA-kompleks., Selvom din polymerase ikke begynder at læse, før temperaturen er hævet i næste trin.

forlængelse eller forlængelse (gentaget 15-40 gange)

i dette trin opvarmes din reaktion hurtigt til 72-80 C. C. Dette er, når din polymerase begynder at læse (i 5-3 retning) og kopiere dit skabelon-DNA (i 3-5 retning). Den højere temperatur under dette trin reducerer ikke-specifikke primer/skabelon DNA-interaktioner, hvilket øger specificiteten af din reaktion., Den nøjagtige temperatur bestemmes dog af din polymerases præference, så læs din emballage. Længden af dette trin afhænger af, hvor længe din DNA-kopi vil være. Typisk kan DNA-polymerase kopiere 1.000 basepar pr. Derfor skal du tillade mindst 1 minut af forlængelsestid pr 1.000 baser. Ved afslutningen af denne inkubation vil nye dobbeltstrengede stykker DNA være blevet skabt, bestående af både skabelon og nyt DNA.

trin 2-4 gentages derefter 15-40 gange

det er rigtigt, at jo flere cyklusser du programmerer, jo flere DNA-kopier vil du oprette., Der er dog en øvre grænse. På et tidspunkt bliver tilgængelige frie nukleotider begrænsende, og for tidligt afkortede DNA-kopier kan blive et problem. Så bliv ikke grådig med din cykling. Mindre, men godt rent PCR-produkt foretrækkes frem for masser af snavset produkt.

endelig forlængelse

Dette er et valgfrit, men ofte anbefalet trin. I dette trin holdes reaktionen ved 70-74.C i flere minutter. (Normalt bruger du den samme temperatur som du brugte i forlængelses-eller Forlængelsestrinnet.) Dette trin gør det muligt for polymeraser at afslutte læsning uanset streng de er i øjeblikket på., Dette valgfrie trin kan hjælpe med at reducere antallet af afkortede kopier i dit endelige produkt.

Final hold

din reaktion er nu afsluttet. Da hele processen kan tage et par timer, udføres PCR-reaktioner ofte natten over, eller når du ellers er trådt væk; det anbefales, at du programmerer din termocycler til at holde dit PCR-produkt ved 4.C, indtil du vender tilbage. På hvilket tidspunkt kan du analysere eller bruge dit produkt eller overføre det til mere passende langtidsopbevaring som dit køleskab.

held og lykke med PCR-ing!