påvisning af Pneumocystis jiroveci i respiratoriske prøver ved fire farvningsmetoder

Pneumocystis jiroveci, tidligere kendt som Pneumocystis carinii, forbliver en vigtig årsag til lungebetændelse hos immunkompromitterede patienter, skønt infektioner med dette middel er faldet efter den udbredte anvendelse af højaktiv antiretroviral terapi (HAART) til human immundefektvirus (HIV) infektion (9, 12). Patienter, der er immunkompromitterede af andre grunde end HIV-infektion, er også i risiko for lungebetændelse forårsaget af P., jiroveci, herunder patienter med hæmatologiske maligniteter, og dem, der har modtaget immunosuppressive midler til behandling af autoimmune sygdomme (2, 11, 12).

selvom der er udviklet en række nukleinsyreamplifikationsassays, herunder realtids-PCR-assays, til påvisning af P. jiroveci, er disse assays ikke almindelige i de fleste kliniske mikrobiologiske laboratorier og er ikke kommercielt tilgængelige (3, 5). Derfor er den vigtigste laboratoriemetode til påvisning af P., jiroveci, en organisme, der ikke kan dyrkes ved standardmetoder, er den direkte visuelle undersøgelse af det kliniske eksemplar efter en eller anden type farvningsmetode (12). En række histokemiske pletter er blevet brugt til at detektere Pneumocystis i kliniske prøver. Disse histokemiske pletter omfatter diff-Quiuik, Grocott-Gomori methenamin sølv (GMS), og Calcofluor hvide pletter. Diff-stainuik stain er en modifikation af Wright stain (3). GMS stain er en sølv nedbør plet almindeligt anvendt til at visualisere svampe i histologiske sektioner (10)., Calcofluor hvid plet er en fluorescerende plet, hvis aktive ingrediens er cellufluor, som uspecifikt binder til beta-bundne polysaccharider, såsom chitin og cellulose, og bruges til direkte visualisering af svampe i kliniske prøver (4). Immunofluorescerende pletter, der anvender antistoffer rettet mod P. jiroveci, er også tilgængelige til direkte påvisning af denne organisme i kliniske prøver (3, 5). Disse pletter ligner de direkte og indirekte immunofluorescerende pletter, der anvendes til påvisning af vira i kliniske prøver., Hver plet har sine fortalere; sammenlignende data i HAART-æraen er begrænsede.

derfor udførte vi en multiinstitutionel vurdering af fire almindeligt anvendte farvningsmetoder til direkte påvisning af P. jiroveci i kliniske åndedrætsprøver. Objektglassene fra undersøgte åndedrætsprøver, hvoraf størstedelen var bronchoalveolære skylleprøver, blev fremstillet under anvendelse af cytocentrifugering. Replicate udstrygninger af 313 respiratoriske prøver indsendt til P. jiroveci-undersøgelse blev undersøgt for tilstedeværelsen af P. jiroveci med Calcofluor whitehite (Fungifluor; Polysciences, Inc., Wararington, Far.), GMS, Diff-Quiuik (Ba .ter Scientific, Mcgra.Park, syg.), og Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc ., Cincinnati, Ohio) pletter. Lysbilleder blev farvet med Merifluor Pneumocystis og Diff-.uik pletter i henhold til producentens anvisninger. For Calcofluor hvide pletter, kan 1 dråbe Fungifluor blev tilføjet til hver slide, coverslip blev anvendt, således at den reagens, der er omfattet hele prøven-med området, og skub fik lov til at sidde i mindst 10 min i et mørkt, fugtigt kammer ved stuetemperatur forud for fortolkning med et fluorescens-mikroskop., For GMS farvning, dias var microwaved for 40 s i en 10% chromsyre løsning, vaskes med vand, og derefter ryddet med 1% natrium metabisulfite til 30 s. Efter de dias, der blev vasket med destilleret vand, og de var placeret i en Coplin krukke indeholder 50.0 ml methenamine arbejder løsning, og microwaved til en anden 65 s., Objektglassene blev skylles igen med destilleret vand, der er behandlet med 1% guld chlorid for 2 til 5 s, skylles med destilleret vand, der er udsat for 5% natriumthiosulfat i 1 min., counterstained med en lys grøn arbejde løsning, ryddet i xylen, der dækkes med dækglas, og undersøges af rutine lys mikroskopi.

hvert af laboratorierne fra de fire deltagende institutioner udførte en af de forskellige pletter og gjorde deres fortolkninger baseret på den farvningsmetode., Individerne på hver institution havde erfaring med farvningsmetoden udført der og fortolkningen af pletten. Prøverne fik unikke identifikationskoder, og hver plet blev undersøgt uafhængigt uden kendskab til resultatet opnået ved en anden farvningsmetode på samme prøve., Mængden af prøve var sjældent utilstrækkelig til at fremstille alle fire lysbilleder; 308 lysbilleder var tilgængelige til farvning med Calcofluor hvid, 310 lysbilleder var tilgængelige til farvning med Merifluor Pneumocystis, 307 lysbilleder var tilgængelige til farvning med Diff-.uik, og 310 lysbilleder var tilgængelige til farvning med GMS. I ingen af de tilfælde, hvor et dias ikke var tilgængeligt på grund af en utilstrækkelig mængde prøve, afhænger kategoriseringen af det pågældende eksemplar som et sandt positivt eller sandt negativt (se nedenfor) af resultatet af det fraværende dias.,

følsomheden, specificiteten og de positive og negative prædiktive værdier blev beregnet ved hjælp af standardmetoder (tabel 1). Andelen af ægte positive og falske positive resultater for parrede tests blev sammenlignet med CHI-s testuare testen ved hjælp af EpiCalc 2000 statistisk soft (are (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

selvom der blev påvist mere ægte positive prøver af Merifluor Pneumocystis-pletten, var dette tal ikke signifikant forskelligt fra dem, der blev påvist af Calcofluor whitehite (P = 0.260) og GMS (p = 0.343) pletter., Tilsvarende var antallet af sande positiver, der blev påvist af GMS og Calcofluor hvide pletter, ikke signifikant forskellige (p = 0.838) fra hinanden. Antallet af sande positive opdaget af Diff-Quik pletten, dog var betydeligt færre end de, der blev fundet ved den Merifluor Pneumocystis (P = 0.002), GMS (P = 0.027), og Calcofluor hvid (P = 0.042) pletter. Antallet af falske positiver var ikke signifikant forskellige mellem de Calcofluor hvid, GMS, og Ob-Quik pletter (hver sammenligning havde en P-værdi på >0.05)., Antallet af falske positiver rapporteret efter farvning med Merifluor Pneumocystis pletten, dog var betydeligt større end dem, der er rapporteret efter farvning med GMS (P = 0.004), Calcofluor hvid (P = 0.001), eller Ob-Quik (P = 0.001).

I nogle tilfælde, en induceret sputum prøver kan blive den første prøve, der er modtaget til vurdering af tilstedeværelse af Pneumocystis i den diagnostiske oparbejdning af en patient med lungebetændelse, der mistænkes for at være forårsaget af denne organisme (6)., Hvis en induceret sputumprøve ikke giver det etiologiske middel til lungebetændelse, derefter kan en prøve fra bronchoalveolær skylning, hvilket er betydeligt dyrere og bærer en lille risiko for patienten, være nødvendig for at opnå diagnostisk materiale., På grund af forskelle i behandlingen af lungebetændelse forårsaget af Pneumocystis mod lungebetændelse forårsaget af andre mikroorganismer, og det mulige behov for en bronkoskopi, der medfører ekstra omkostninger og risiko for patienten, i tilfælde af, at en diagnose ikke er etableret, er det vigtigt, at den bedst mulige farvning metode, der anvendes til påvisning af denne organisme.,

Desuden betydningen af, at en følsom og specifik farvning metode i den æra af HAART er særlig vigtig, da den lavere forekomst af lungebetændelse forårsaget af Pneumocystis påvirker den positive prædiktive værdi af analysen, der har en specificitet mindre end 100% (9). Selvom forekomsten af lungebetændelse forårsaget af Pneumocystis er forskellig i HAART-æraen end i pre-HAART-æraen, er valget af den optimale farvningsmetode til påvisning af Pneumocystis også vigtig for patienter med andre immunkompromitterende tilstande, der er i risiko for infektion., I virkeligheden, valg af optimal farvning metode kan være mere vigtigt for påvisning af Pneumocystis i de ikke-HIV-smittet, immunkompromitterede patienter, da det har vist sig, at respiratorisk prøver fra disse patienter har en lavere byrde af organismer end dem, der er fra HIV-inficeret, immunkompromitterede patienter (6).

efter vores erfaring var diff-stainuik-pletten ikke et effektivt middel til screening for tilstedeværelsen af P. jiroveci (dvs.en primær farvningsmetode) på grund af den lave følsomhed og negative forudsigelige værdi af denne plet. Betydeligt flere eksemplarer, der indeholdt P., jiroveci blev savnet af diff-methoduik-metoden end med Calcofluor whitehite, Merifluor Pneumocystis og GMS. Raab et al. beskriv også både en lav følsomhed (68%) og en lav specificitet (88%), når Diff-stainuik-pletten alene blev anvendt til påvisning af Pneumocystis og andre svampe i bronchoalveolære skylleprøver (10). Disse fund er imidlertid i modsætning til dem fra andre grupper, der har rapporteret, at diff-.uik-metoden var sammenlignelig med GMS-farvningsmetoden til påvisning af Pneumocystis (7, 8)., En gruppe rapporterede, at diff-methoduik-metoden var mere følsom end Calcofluor hvid, direkte immunofluorescerende farvning og endda PCR, men disse resultater er ikke bekræftet (1).omvendt var Merifluor Pneumocystis-pletten den mest følsomme farvningsmetode og kan vise sig nyttig som en skærm for at udelukke forekomsten af Pneumocystis, men det var den mindst specifikke metode i denne undersøgelse. Antallet af falsk-positive resultater med Merifluor Pneumocystis-pletten var imidlertid signifikant større end det, der blev rapporteret for hver af de andre pletter., Merifluor Pneumocystis-pletten havde en positiv forudsigelsesværdi på kun 81, 9% sammenlignet med de andre tre metoder, som alle havde positive forudsigelsesværdier større end 96%. Ng et al. har også beskrevet tilsyneladende falsk-positive resultater med denne farvningsmetode (8). Derfor foreslår vi, at hvis Merifluor Pneumocystis anvendes som den primære farvningsmetode i et klinisk mikrobiologisk laboratorium, skal bekræftelse med en anden metode udføres for at øge specificiteten og den positive forudsigelsesværdi af det endelige testresultat.,

følsomheden af både Calcofluor whitehite-og GMS-pletterne var mellemliggende mellem dem af diff-Pneumuik-og Merifluor Pneumocystis-pletterne, men de var meget specifikke og havde positive forudsigelsesværdier over 96% og negative forudsigelsesværdier over 93%. Fraire et al. har også beskrevet Calcofluor whitehite-og GMS-pletterne som sammenlignelige til påvisning af Pneumocystis med 92, 6% overensstemmelse (4). Baughman et al., (1a) beskriver også følsomheden af en indirekte immunofluorescerende antistoffarvning, der er rettet mod Pneumocystis og overlegen i følsomhed sammenlignet med en modificeret stainright-plet og en GMS-plet, men de rapporterede om et enkelt falsk-positivt resultat og derfor en meget højere specificitet end vi beskriver. Det er muligt, at man med yderligere praksis lettere kunne genkende de patognomoniske former med diff-Quiuik-pletten og derved øge følsomheden af dette assay., Tilsvarende, måske med yderligere erfaring med Merifluor Pneumocystis-pletten, kunne man lære at skelne bedre mellem ægte positiv og falsk positiv farvning og derved mindske antallet af falsk positive resultater.

efter vores erfaring har Calcofluor whitehite-og GMS-pletterne de bedste parametre til rutinemæssig brug i et klinisk laboratorium. Selvom disse assays var mindre følsomme end immunofluorescerende assay, de var meget specifikke og havde mere end acceptable positive og negative prædiktive værdier.,

• Copyright © 2004 American Society for Microbiology