“RNA-sekventering er en næste generations sekventeringsmetode med høj gennemløb, der bruges til at analysere genekspressions-og transkriptomiske undersøgelser.”
ribonukleinsyre er en type nukleinsyre, der hovedsageligt er involveret i genekspression, genregulering og kodning / dekodning af information.
mRNA – messenger RNA er en kodende sekvens af et gen impliceret i syntesen af protein, cirka 4% af RNA-puljen består af mRNA, mens resten er ikke-kodende RNA ‘ er., 90% af RNA er ikke-kodende, er de vigtige for at udføre forskellige funktioner.
for eksempel
- tRNA – overfører aminosyren til ribosomalt sted, mens oversættelsen.
- rRNA – ribosomalt RNA hjælper med oversættelse.
- microRNA-genekspression og regulering af genekspression.
- siRNA – beskytter en celle fra de eksogene RNA ‘ er.
et mRNA er en enkeltstrenget nukleinsyre transkriberet fra et gen, og hvorfra proteinet oversættes.,
mRNA eller transkription indeholder kun de kodende sekvenser fra et gen. Således besidder den kun de sekvenser, der kræves i proteindannelsen.
fremover kan ekspressionsmønsteret for det beslægtede gen bestemmes ved at analysere et mRNA.
total RNA-undersøgelse giver os også en ID.om, hvilke gener der er knyttet til proteindannelsen, og hvilke der ikke er.
betyder, at mængden af total RNA, mRNA og ncRNA kan bestemmes ved at studere det totale RNA.,
Transkriptomik er undersøgelsen af hele mRNA – ofte kaldet transkriptomer eller total RNA, der er til stede i en celle-eller cellepopulation.
Ved at analysere transkriptomet af en celle kan hele puljen af genekspressionen undersøges. En af de vigtige teknikker, der anvendes i transkriptomiske undersøgelser, er RNA-sekventering.
transkriptomet af en organisme er større, kompleks og mere usikker, i modsætning til genomet. transkriptomet varierer i forskellige tilstande og et andet miljø., Livsstil, kost, motion, miljø, forhold og andre eksterne faktorer spiller en væsentlig rolle i transkriptomregulering.
her i RNA-sekventeringen sekventeres cDNA ‘en syntetiseret fra mRNA’ et og kvantificeres i en se .uencer. I denne artikel vil vi kun diskutere RNA-sekventering, men før det læses vores tidligere artikel om transkriptomik: Hvad er Transkriptomik?,
nøgleemner:
princippet om RNA-sekventering:
RNA-sekventering er en næste generations RNA-sekventerings-og kvantificeringsmetode med høj gennemløb, der bruges til at studere transkriptomik og genekspression.
en cDNA er konstrueret ud fra total mRNA gennem processen med omvendt transkription og fragmenteret. Samtidig, adapter ligering og bibliotek forberedelse praktiseres før du gør sekventering. se .uenceren læser og kvantificerer cDNA ‘en, der supplerer mRNA’ et.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
isolering af RNA er en kedelig proces i sammenligning med DNA-isolering. RNA ‘ et kan let nedbrydes. Risikoen for forurening er også høj i RNA-isolering.
der skal derfor udvises ekstra forsigtighed, mens RNA isoleres, og der kræves eksperthåndtering for at gøre det.
højt udbytte ren RNA er skal kræve for RNA sekventering.
renheden og mængden af RNA måles ved hjælp af Nanodrop eller quubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.
nu er vores RNA-prøve klar til næste trin.,
revers transkriptase PCR:
et andet innovativt sæt til RNA-sekventering er at gøre revers transkriptase PCR, hvor RNA er Revers transkriberet til DNA.
ved hjælp af en speciel type polymerase kendt som DNA revers transkriptase syntetiseres cDNA fra mRNA ‘ et.
Lær mere om RT PCR her: Reverse transkriptase PCR.
Andenstrengs-cDNA-syntese:
efter at cDNA ‘en er syntetiseret fra mRNA’ et, skal den ANDENSTRENGS-DNA-syntese kræves. Til dette udføres PCR under anvendelse af den normale Ta.DNA-polymerase i konventionel PCR.,
polymerasen tilføjer dNTP ‘ er til den voksende DNA-streng ved hjælp af primersættet.
Biblioteksforberedelse:
det første trin i biblioteksforberedelsen eller NGS-biblioteksforberedelsen starter med fragmenteringerne.
Ved hjælp af den specielle type restriktionsendonukleaser er hele sæt DS cDNA fragmenteret for NGS.
Bemærk:
bibliotekets forberedelse varierer fra platform til platforme, da nogle fragmenter mRNA før udførelse af revers transkriptase, mens nogle udfører det senere efter forberedelsen af cDNA.,
i det sidste trin i bibliotekets forberedelse ligeres enderne med adaptersekvenserne og forstærkes til reparation af enderne. dA-hale er valgfri i tilfælde af mRNA bibliotek.
Bibliotek rensning:
hele biblioteket renses ved hjælp af klar til brug DNA rensning kit.
i det sidste trin er det meget vigtigt at rense hele fragmentbiblioteket for at koncentrationen af biblioteket vurderes ved hjælp af den kvantitative PCR eller bioanaly .er.,
Bemærk:
for en nybegynder tror jeg, biblioteksforberedelse og DNA-fragmentering er meget svært at forstå, så vi synes, vi skal skrive en hel artikel om genomisk DNA-fragmentering, biblioteksforberedelse og dens betydning i NGS.
lad os alligevel gå videre,
i det næste trin sendes prøven af fragmenteret DNA til sekventering.
DNA-sekventering:
nu er prøven sekventeret i NGS-maskinen med høj gennemstrømning, som læser sekvensen såvel som kvantificerer nukleinsyren også., kemien bag sekventering af cDNA afhænger af, hvilke platforme vi bruger, selvom den udbredte metode er brugen af fluorescens Kemi.
I se .uenceren “læses” individuelle fragmenter separat og sekventeres. De endelige data sendes til bioinformatik lab for post-sekventering analyse.,
Different types of RNA and its function:
| Abbreviation | RNA types | Function |
| mRNA | Messenger RNA | Codes for protein |
| tRNA | Transfer RNA | Transfer amino acid to the site of translation., |
| rRNA | Ribosomal RNA | Catalyse the translation reaction |
| miRNA | microRNA | Gene regulation |
| siRNA | Smaller interfering RNA | Gene regulation and maintaining gene expression. |
| LncRNA | Long non-coding RNA | Transcriptional regulation and epigenetic regulations., |
| snRNA | Small nuclear RNA | Helps in mRNA splicing and related functions |
| snoRNA | Small nucleolar RNA | Helps in RNA nucleotide modification |
| piRNA | Piwi-intercalating RNA | Function in defence against transposon; transposon defence system. |
| scaRNA | Small Cajal body-specific RNA | Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., |
| shRNA | lille hårnål RNA | syntetisk RNA-molekyle hjælper med genregulering og styring af genekspression. |
Transkriptomdata analyse:
et af de kedelige job, som vi allerede diskuterede i den foregående artikel, er transkriptomdata analyse og fortolkning af resultater. NGS data er enorme og mere komplekse.,
helt ærligt er undervisning i dataanalyse af transkriptomik ikke mulig, man skal tage praktisk praksis for at lære, stadig vil jeg forsøge at lære dig, hvad der er næste i denne proces. forskellige fragmenter sekventeres i maskinen, og data indsamles. I det næste trin, baseret på fragmenternes flankerende region, arrangeres de såkaldte “contings” for at få splejsningsvarianter.
i det næste trin sammenlignes transkriptomet med referencesekvensen eller kan samles de novo.,
En kort oversigt over hele processen af RNA-seq.
hele transkriptomsekvensering:
hele transkriptomet af en celle eller væv – alle RNA ‘ er (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA og siRNA) sekventeres og kvantificeres. Med andre ord kan vi sige, at både roman såvel som kendte transkripter kan sekventeres.
for at gøre det ekstraheres hele sæt RNA fra vævsprøven.,
mål RNA-sekventering:
en genspecifik, klynge af genspecifikke, en Path .ay-specifik eller sygdomsrelaterede transkriptomer sekventeres i den målspecifikke RNA-sekventering.
Target RNA sekventering er mere overkommelig og præcis end hele transkriptom sekventering. Desuden kræves mindre mængde RNA-prøve til at udføre eksperimentet.
lille RNA-sekventering:
en af de mest nye teknikker inden for RNA-sekventering er at studere det mindre ikke-kodende RNA i en celle, fordi de er forbundet med så mange funktioner i et genom., mindre RNA-molekyler som miRNA, siRNA og piRNA kan kvantificeres og sekventeres gennem den NGS-baserede RNA-sekventeringsmetode til forskellige anvendelser.
mRNA-sekventering:
sekvenser hele mRNA-transkriptet ved hjælp af poly(a) halevalg anvendt til genekspressionsstudier. Brug af mRNA-sekventering kendt såvel som ny transkriptændring kan detekteres.
fordele ved RNA-sekventering:
en af de vigtigste fordele ved RNA-sekventering er ikke behov for forudgående sekvensinformation., Da hele processen ikke er baseret på den probebaserede kemi, er forudgående sekvensoplysninger til design af sonden ikke påkrævet her.
mere præcis og følsom genekspression undersøgelse kan gøres.
bredere dynamisk udvalg.
indfang både kendte såvel som nye ændringer af transkriptet, selvom der ikke er nogen sekvensinformation tilgængelig.
selvom der ikke findes nogen information om referencesekvensen, kan RNA-sekventering anvendes for alle arter.
relateret: syntetisk genom – metoder, applikationer og udfordringer.,
konklusion:
endegyldigt kan vi sige, at RNA se.metoden er mere avanceret og præcis i forhold til microarray. De novo-mutationer kan også opdages ved hjælp af det.