GLP-1 e secreção de insulina
Visão Geral da via sensível ao ATP.
a secreção de insulina estimulada pela Glucose (GSIS) é regulada por uma série de vias sinalizadoras iónicas e não iónicas, também conhecidas como as vias dependentes e independentes do KATP (34,35). O mecanismo do acoplamento estímulo-secreção dependente do KATP é revisto na Fig. 1., Em geral, a célula-β adapta a secreção de insulina aos níveis prevalecentes de glucose no sangue através do metabolismo da glucose. Quando os níveis de glicose, aumento, a taxa de glicólise aumenta, o que gera substratos (principalmente piruvato) para o metabolismo oxidativo mitocondrial, o resultado é a geração de ATP, ou mais corretamente, um aumento na ATP a ADP relação (36). Este evento fornece a ligação funcional entre um estímulo de glicose e a secreção de insulina., O aumento desta razão causa o fechamento dos canais KATP das células β, levando à despolarização da membrana plasmática, ativação dos canais Ca2+ dependentes de voltagem (VDCCs), e um aumento na concentração intracelular de Ca2+ (i), O principal gatilho para a secreção de insulina. A repolarização das células β é provavelmente mediada por canais K+ (Kv) dependentes de voltagem e canais K+(KCA) dependentes de voltagem Ca2+ (KCA) dependentes de voltagem (37), que se abrem em resposta à despolarização da membrana induzida pela glicose para restaurar o fluxo externo de K+., GLP-1 é proposto para modular GSIS, regulando a atividade de vários canais iônicos envolvidos na secreção de insulina dependente de KATP, bem como passos distais à modulação de canais.canais KATP de células β e GLP-1.
um dos muitos efeitos celulares observados do GLP – 1 é a inibição dos canais KATP das células β (38-40). A despolarização da membrana resultante induzida pelo fecho do canal KATP inicia o fluxo de Ca2+ através de VDCCs e desencadeia a libertação exocitótica da insulina., A figura 2 mostra o efeito excitatório do GLP-1 no potencial da membrana e o seu efeito inibitório nas correntes nativas do canal KATP das células INS-1 e nas correntes mediadas pelos canais KATP recombinantes (SUR1/Kir6.2) co-expressas com o receptor GLP-1 numa linha celular de mamíferos. As consequências fisiológicas do encerramento do canal KATP-1 facilitado pelo GLP-1 seriam 1) aumentar a excitabilidade das células já acima do limiar para a libertação de insulina e 2) aumentar a percentagem de células-β que secretam activamente a insulina a concentrações de glucose Normalmente abaixo do limiar para a libertação de insulina.,
a visão consensual é que o efeito inibitório do GLP-1 nos canais KATP é dependente do campo/PKA (38-41), embora um estudo usando células-β Do Rato discorde (42). Esta afirmação de Suga et al. (42) baseia-se na constatação de que os campos de concentração Rp específicos do inibidor da PKA (100 µmol/l) não foram capazes de impedir a despolarização celular e a redução da corrente KATP de células inteiras provocada pelo GLP-1. A exaustividade da inibição da PKA pelos campos de PR deve ser questionada porque, no mesmo estudo, a forskolin induziu uma secreção significativa de insulina mesmo na presença de campos de PR. Em segundo lugar, Suga et al., sugira que o GLP – 1 causa um ligeiro aumento na sensibilidade ATP do canal KATP de tal forma que, a baixas concentrações de ATP micromolar, o canal KATP será mais suscetível ao fecho. No entanto, na célula-β pancreática normal do rato, os níveis milimolares de ATP estão presentes (43), e nestes níveis fisiológicos de ATP, a probabilidade aberta do canal KATP (Po) muito semelhante na ausência e presença de GLP-1 é prevista da seguinte forma. Nossos cálculos indicam que com um intracelular de 2 mmol/l, O canal de KATP Po é reduzido de 0.005 para 0.003 na presença de GLP-1., É plausível que uma mudança para a esquerda da sensibilidade ATP ocorra na presença de GLP-1. However, the observed magnitude of GLP-1-induced KATP current reduction seen in whole-cell patch-clamp recordings (Fig. 2) é provavelmente demasiado grande para ser contabilizado apenas pelas pequenas diminuições de Po calculadas a partir dos dados de Suga et al. (42). O trabalho recente do nosso laboratório mostrou que o inibidor específico da membrana permeante PKA H-89 (44) é capaz de inibir completamente a redução da corrente KATP por GLP-1 (45)., Além disso, outros mostraram resultados semelhantes usando campos de PR-8-Br, um análogo mais permeável à membrana dos campos de PR (38,41). As acções do GLP – 1 nos canais do KATP podem também envolver outras vias sinalizadoras, uma vez que a inibição do canal do KATP pelo GLP-1 nas células-β do Ratinho demonstrou ser dependente da calmodulina, utilizando os inibidores da calmodulina W-7 e o calmidazólio (46).a dependência da glucose das acções de BPL-1 foi bem estabelecida, embora os mecanismos precisos para esta dependência não sejam claros (41,47)., No entanto, as acções celulares do PKA no canal KATP podem fornecer uma ligação entre esta cinase e a sensibilidade à glucose do GLP-1. Outros grupos têm mostrado que a adição da subunidade catalítica de pKa (cPKA) a sistemas excisados contendo canais KATP resulta em um aumento da corrente KATP (39,48). O nosso laboratório mostrou recentemente que o efeito do cPKA na corrente KATP depende do ADP (45). Quando os níveis de ADP são elevados, a cPKA aumenta a corrente do canal KATP num sistema recombinante, consistente com os resultados de Lin et al. (39)., Inversamente, como os níveis de ADP são reduzidos, cPKA reduz a corrente KATP (45). Fisiologicamente, isto pode resultar num aumento negligenciável da excitabilidade das células β quando os níveis de glucose são baixos (elevados ), enquanto que quando os níveis de glucose sobem (baixos ), o encerramento dos canais KATP-1 mediado pelo GLP, através de uma via dependente do PKA, leva à despolarização das membranas e a aumentos subsequentes da excitabilidade das células β., Deve ser dada especial atenção à relação ATP-ADP celular ao considerar a atividade do canal KATP porque são mudanças nesta relação, mais do que simples mudanças no intracelular per se, que governam a atividade dos canais KATP na célula β intacta. A ATP livre é altamente tamponada dentro da célula por membrana e ATPases citosólicas (43) e prevê-se que não se altere significativamente com o aumento do metabolismo da glucose (36). Em contraste, a mudança recíproca no ADP, que não é tamponado na mesma medida, é mais significativa e resulta em uma mudança na razão ATP-para-ADP (36)., De facto, a importância do ADP no controlo da actividade do canal KATP das células β foi demonstrada porque as mutações na região sensível ao ADP do canal KATP humano conduzem a secreção descontrolada de insulina e hipoglicemia (49). A identidade molecular do(s) Local (s) de fosforilação PKA é de importância significativa e ainda está a ser investigada. Ambos o Kir6.,As subunidades 2 e SUR1 do canal KATP contêm sequências-alvo putativas para a fosforilação mediada pelo PKA (39,48), e a mutação sistemática destes resíduos deve clarificar as contribuições relativas destes sítios para a acção do PKA no canal KATP.
GLP-1, VDCCs, and intracelular Ca2+ stores.
GLP – 1 tem sido mostrado para melhorar as correntes através de VDCCs em ratos, ratos e células-β humanas (38,50–52), embora a magnitude deste efeito varia e muitas vezes não atinge significância estatística., Em células β humanas únicas, o GLP-1 demonstrou aumentar a actividade do VDCC Tipo L e a amplitude dos transientes intracelulares de cálcio evocados pela despolarização, um efeito que representou 40% do aumento do exocitose potenciada com GLP-1 (52). Embora os Vdcc de tipo L sejam classicamente considerados como os principais reguladores do influxo de Ca2+ levando à secreção de insulina, as células β são conhecidas por expressar múltiplas isoformas do canal Ca2+ (53). Pereverzev et al. (54) relatou recentemente que os ratinhos que não possuem a isoforma A1E da Cav2.3 apresentam uma redução da tolerância à glucose e uma diminuição das respostas da insulina à glucose., Especula-se que a regulação da proteína G deste canal pode modular a secreção de insulina com base na regulação muscarínica do receptor da acetilcolina de VDCCs in vitro (55).em células de insulinoma HIT-T15, transfectadas com o receptor GLP-1, descobrimos que o GLP-1 provoca um aumento das correntes Ca2+ dependentes de voltagem (ver 56 e Fig. 3A). Isto deve-se, pelo menos em parte, a uma mudança para a esquerda na dependência da tensão de ativação reminiscente do efeito da fosforilação VDCC por PKA (57,58)., Também observamos uma mudança para a direita na dependência de voltagem da inactivação em estado estacionário de tal forma que, na presença de GLP-1, menos canais foram efetivamente desativados em um dado potencial de retenção (50). Isto é apoiado por Britsch et al. (50), que sugerem que o tratamento GLP-1 das células-β Do Rato atrasa a inactivação das correntes Ca2+ dependentes da tensão. Adicionalmente, o GLP-1 provocou um aumento do cálcio intracelular apenas após a adição de glucose, um efeito que foi bloqueado em parte pelos antagonistas do VDCC(Fig. 3C)., A capacidade do GLP-1 para melhorar as correntes Ca2+ é, como o efeito nos canais KATP, dependente do campo (51,52), baseado na capacidade dos campos de Rp para evitar um aumento das correntes. De facto, o tratamento das células β Do Rato com DIBUTIRIL-AMP, um campo analógico permeável à membrana, replicou o efeito do GLP-1 sobre as correntes Ca2+ (51)., Além disso, em nossos estudos (56), o VDCC resposta GLP-1 foi perdido no HIT-T15 células expressando um mutante GLP-1 receptor falta de crítica resíduos necessário para o acoplamento a adenilil ciclase, considerando que VDCC atividade pode ainda ser reforçada pelo acampamento independente agonista BAYK8644. Evidências recentes sugerem que uma proteína de Ancoragem a-kinase (AKAP), AKAP18, aponta PKA para VDCCs e que esta cinase pode estar envolvida na modulação GLP-1 destes canais (59).,
In addition to effects on VDCCs, GLP – 1 can mobilize intracelular calcium stores in a cAMP-dependent manner (60,61), possibly contributing to the oscillatory i response to GLP-1 seen in HIT-T15 cells (Fig. 3C) (62). Nossos estudos sugerem que a aplicação GLP-1 resulta em oscilações em I nas células HIT-T15 e que essas oscilações não são abolidas (embora sejam diminuídas em amplitude) pela remoção de Ca2+ extracelular ou pelo bloqueio VDCC (Fig. 3C)., De facto, em vários tipos de células, as oscilações Ca2+ induzidas por um agonista são causadas principalmente pela libertação de Ca2+ através do trifosfato de inositol (IP3) e/ou reservas sensíveis à ryanodina (63-65). Em células β, o GLP – 1 mobiliza as reservas de Ca2+ em grande parte sensibilizando o receptor de ryanodina (provavelmente a isoforma tipo 2, RYR-2) para o processo de Libertação de Ca2+induzido (CICR) (61,66). Vários estudos demonstraram que o GLP-1 pode aumentar o I de forma independente do PKA (67-69)., Este mecanismo foi recentemente atribuído à CICR a partir de reservas sensíveis à ryanodina através do factor de troca nucleótido da guanina regulado pelo campo II (GEF-II ou Epac2) e da sua interacção com o pequeno G-protein Rap1 relacionado com o Ras ou com o pequeno g-proteico Rim2 da Rab3 (68). A importância do campo-GEF-II-Rim2 foi demonstrada, porque a inactivação deste complexo (por oligonucleótidos antissensivos ou construções mutantes) atenuou a resposta secreta de Ilhéus de rato ou células de insulinoma MIN6 ao GLP-1 (67)., Uma vez que a afinidade do campo para o PKA é muito maior (∼100 nmol/l) em comparação com o campo-GEF-II (∼10 mmol/l), é interessante especular que a via campo-GEF-II estimulada pelo GLP-1 possa operar com um aumento no campo local e não com mudanças globais., Apesar de GLP-1 receptor de sinalização estimula IP3 produção de GLP-1 receptor-expressão de células COS (70), papel para o IP3-sensível Ca2+ lojas no global eu estiver em dúvida, porque o GLP-1 estimulada IP3 produção primária β-células é declaradamente mínimo (71,72) e o antagonista do receptor de IP3 xestospongin C não conseguiu bloquear a liberação intracelular de Ca2+ lojas por forscolina tratamento (68). No entanto, a libertação de Ca2+ com regulação IP3 a partir de grânulos de insulina foi sugerida pelos estudos de Nakagaki et al., (62), who suggest that GLP-1 may uniquely regulate temporal and spatial release of intracelular calcium through local IP3 signaling. Assim, a libertação mediada pelo GLP-1 de reservas intracelulares, juntamente com a potenciação da entrada Ca2+ através do VDCCs, provavelmente contribuem para o efeito insulinotrópico do GLP-1.canais KV de células β e GLP-1.correntes K+ dependentes da tensão, tais como as mediadas pelos canais Kv ou KCa, mediam a repolarização das células β após um estímulo despolarizante, como a glucose (37)., Recentemente, nós relatamos que os canais familiares Kv1 e Kv2 regulam a secreção de insulina, porque o nocaute funcional dominante-negativo de qualquer uma dessas famílias de canais melhorou a GSIS (73). Os canais Kv2. 1 mediam a maioria deste efeito (>60%), cujo mecanismo envolve a despolarização da membrana estimulada pela glicose e a entrada Ca2+ (observações não publicadas). Como as correntes KV das células β São reguladores potentes dependentes da glicose da secreção de insulina, nós hipotetizamos que os secretagogos fisiológicos, como o GLP-1, podem regular a função do canal Kv., De fato, relatamos em outros lugares neste suplemento que o agonista do receptor GLP-1 exendin 4 inibe as correntes K+ dependentes de voltagem no exterior do rato-células-β-clampadas na configuração de toda a célula em 40% e prolonga significativamente o curso de tempo de repolarização das células-β após despolarização transitória por injeção de corrente. Isto compara-se a uma redução de 86% nas correntes K+ externas conseguidas com o antagonista geral do canal KV tetraetilamónio. O GLP-1 antagonizou as correntes K+ dependentes da voltagem nas células β Do Rato na ausência de glucose., No entanto, este efeito pode ainda contribuir para a dependência da glucose do efeito insulinotrópico do GLP-1, uma vez que não se espera que os canais Kv estejam normalmente activos até após uma despolarização induzida pela glucose da membrana celular (37). Adicionalmente, e semelhante ao efeito do GLP-1 nos outros canais iónicos mencionados acima, a inibição mediada pelo exendin 4 dos canais KV das células β depende da sinalização do campo. Um estudo recente, no entanto, sugeriu que a sinalização do campo não era suficiente por si só para antagonizar as correntes K+ dependentes de voltagem em uma linha celular de secreção de insulina (INS-1) (74).,numerosos estudos têm descrito efeitos de alterações hormonais nas correntes K+ dependentes de voltagem, tanto excitatórias como inibitórias. O melhor caracterizado destes efeitos é a quebra da corrente K+ dependente da voltagem nos linfócitos e a sub-regulação nos miócitos cardíacos (75,76). Em ambos os tecidos, a via de sinalização cAMP/PKA tem sido implicada na regulação destes canais (76,77)., Relatórios sugerem que o campo pode reduzir as correntes K+ dependentes de voltagem nos linfócitos murinos (76) e uma linha celular pituitária (78), mas melhorar as correntes K+ dependentes de voltagem nos miócitos cardíacos (77), um achado que foi confirmado no nível de canal único nos miócitos atriais sapos (79) e a lula gigante axon (80)., A fosforilação pode ocorrer directamente no canal, uma vez que a fosforilação PKA de um canal KV atrial próximo da actividade do canal potenciado de NH2-terminus (81), e a fosforilação das subunidades α Do Canal KV1 regula a extensão da inibição destes canais conferida por uma subunidade β regulamentar (82). A fosforilação das subunidades β Pode também modular a interacção regulamentar com subunidades α-formadoras de poros (83). Foi recentemente demonstrado que a regulação de um canal KV cardíaco (KvLQT) por campo requer a expressão de AKAP15/18 ou AKAP79 (84)., Adicionalmente, um aumento da corrente k+ dependente da voltagem está implicado na inibição induzida pela epinefrina do aumento dependente da glucose em I nas células beta de ob/ob e +/+ Ratinho (85), uma vez que o efeito foi revertido pelo tetraetilamónio. Curiosamente, o efeito inibitório da epinefrina em i também foi revertido pelo ativador da adenil ciclase forskolin (85). Portanto, acreditamos que há evidências crescentes que sugerem que a Modulação hormonal das correntes Kv é fisiologicamente importante. Especificamente, espera-se que a inibição destas correntes pelo GLP-1 conduza a um aumento da excitabilidade das células β.,
GLP-1 e outros canais iónicos de células β.há muito que se sabe que os aumentos no campo intracelular melhoram as correntes Na+ (86), um efeito que pode ser mediado através da fosforilação directa do canal por PKA (87). Uma resposta transitória Na+ atual ao campo foi descrita pela primeira vez em neurônios e denominada INa(campo) (88)., Na insulino-secreção de células, RNA expressão do não-seletivos cação genes mSTRPC4 e LTRPC2 foi recentemente detectada em insulinoma células de humanos e ilhotas, respectivamente (89), e o acampamento foi relatado para induzir a expressão do gene de mNSC1, que codifica um mouse inespecíficos cação do canal (NSCC) (90). Pensa-se que o GLP-1 melhora um NSCC que transporta predominantemente correntes Na+ (91,92). Este efeito ocorre através da ativação do GLP-1 da sinalização do campo e da libertação de reservas intracelulares de Ca2+ e pode servir como mais uma importante via modulatória para o GLP-1 na célula-β (40)., Não é claro se os NSCCs ativados pelas BPL – 1 correspondem à corrente catiónica não seletiva produzida pela ativação do receptor sensível a Ca2+(93), mas este último efeito não envolve a ativação da subunidade Gs e pode, portanto, não envolver a via cAMP/PKA.
sabe-se pouco sobre os efeitos do GLP-1 noutros canais iónicos. Foram detectadas correntes Cl activadas por edema celular nas células secretoras de insulina (94), mas não é claro qual o papel destes canais na secreção de insulina., Canais Cl tais como fibrose cística, reguladores de condutância transmembranar e canais Cl exteriormente retificantes são ativados por sinalização cAMP/PKA (95). Se ocorrer na célula-β, este efeito tenderia a promover a despolarização. Um relatório sugere que o GLP-1 ativa uma corrente Cl-sensível a Ca2+nos oócitos Xenopus expressando o receptor GLP− 1 (96), um efeito que dependia da mobilização intracelular Ca2+ dependente de Ins(1,4,5)P3 (96). No entanto, resta determinar se o GLP-1 pode estimular as correntes Cl nas células secretoras de insulina.