Detection of Pneumocystis jiroveci in Respiratory Specimens by Four Staining Methods

Pneumocystis jiroveci, anteriormente conhecido como Pneumocystis carinii, continua a ser uma causa importante de pneumonia em doentes imunocomprometidos, embora as infecções com este agente tenham diminuído após o uso generalizado de terapêutica anti-retroviral altamente activa (HAART) para a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Humana (VIH) (9, 12). Os doentes imunocomprometidos por outras razões que não a infecção pelo VIH também estão em risco de pneumonia causada por P., jiroveci, incluindo doentes com doenças malignas hematológicas e aqueles que receberam agentes imunossupressores para o tratamento de doenças auto-imunes (2, 11, 12).embora uma variedade de testes de amplificação de ácido nucleico, incluindo testes de PCR em tempo real, tenham sido desenvolvidos para a detecção de P. jiroveci, estes testes não são comuns na maioria dos laboratórios de Microbiologia Clínica e não estão disponíveis comercialmente (3, 5). Portanto, o principal método laboratorial para a detecção de P., jiroveci, um organismo que não pode ser cultivado por métodos padrão, é o exame visual direto da amostra clínica após algum tipo de método de coloração (12). Uma variedade de manchas histoquímicas foram usadas para detectar Pneumocystis em amostras clínicas. Estas manchas histoquímicas incluem a prata de Diff-Quik, Grocott-Gomori metenamina (GMS), e manchas brancas de Calcofluor. Diff-Quik stain é uma modificação da stain Wright (3). A mancha GMS é uma mancha de precipitação de prata comumente usada para visualizar fungos em seções histológicas (10)., Calcofluor white mancha é uma fluorescente mancha, o ingrediente activo do que é cellufluor, que nonspecifically liga de beta-vinculado polissacarídeos, como a quitina e a celulose, e é utilizado para a visualização direta de fungos em amostras clínicas (4). As manchas imunofluorescentes, que empregam anticorpos dirigidos contra P. jiroveci, também estão disponíveis para a detecção direta deste organismo em amostras clínicas (3, 5). Estas manchas são semelhantes às manchas directas e indirectas imunofluorescentes utilizadas para a detecção de vírus em amostras clínicas., Cada mancha tem seus proponentes; dados comparativos na era HAART são limitados.portanto, realizamos uma avaliação multi-institucional de quatro métodos de coloração comumente usados para a detecção direta de P. jiroveci em amostras respiratórias clínicas. As lâminas de amostras respiratórias estudadas, a maioria das quais eram amostras de lavagem broncoalveolar, foram preparadas com citocentrifugação. Foram examinados esfregaços replicados de 313 amostras respiratórias submetidas ao exame de P. jiroveci para detecção da presença de P. jiroveci com o branco de Calcofluor (Fungifluor; Polysciences, Inc.,, Warington, Pa.), GMS, Diff-Quik (Baxter Scientific, McGraw Park, Ill.), e Merifluor Pneumocystis (Meridian Bioscience, Inc., Cincinnati, Ohio) stains. As lâminas estavam manchadas com a Pneumocystis Merifluor e as manchas de Diff-Quik de acordo com as instruções do fabricante. Para Calcofluor white coloração, 1 gota de Fungifluor foi adicionado para cada lâmina, lamínula foi aplicada, de modo que o reagente cobriu toda a amostra contendo área, e a apresentação foi permitido sentar-se por pelo menos 10 min no escuro da câmara húmida a uma temperatura antes de interpretação com um microscópio de fluorescência., Para GMS de coloração, as lâminas foram microwaved por 40 s em 10% de ácido crómico em solução, lavado com água e, em seguida, limpou com 1% de metabissulfito de sódio por 30 s. Após as lâminas foram lavadas com água destilada, eles foram colocados em um tinas contendo de 50,0 ml de solução de metenamina e microwaved para outro 65 s., As lâminas foram novamente enxaguadas com água destilada, tratadas com 1% de cloreto de ouro durante 2 a 5 s, enxaguadas com água destilada, expostas a 5% de tiossulfato de sódio durante 1 min, contrastadas com uma solução de trabalho verde-claro, limpas em xileno, cobertas com folhas de cobertura e examinadas por microscopia de rotina.

cada um dos laboratórios das quatro instituições participantes realizou uma das diferentes manchas e rendeu as suas interpretações com base nesse método de coloração., Os indivíduos em cada instituição tiveram experiência com o método de coloração realizado lá e a interpretação da mancha. Os espécimes receberam códigos de identificação únicos, e cada mancha foi examinada independentemente, sem conhecimento do resultado obtido por outro método de coloração sobre o mesmo espécime., A quantidade de amostras raramente foi insuficiente para fazer todas as quatro lâminas; 308 lâminas estavam disponíveis para coloração Com Branco Calcofluor, 310 lâminas estavam disponíveis para coloração com Merifluor Pneumocystis, 307 lâminas estavam disponíveis para coloração com Diff-Quik, e 310 lâminas estavam disponíveis para coloração com GMS. In none of the instances wherein a slide was unavailable due to an insufficient quantity of specimen did the categorization of that specimen as a true positive or true negative (see below) depend on the result of the absent slide.,

a sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos foram calculados por métodos padrão (Quadro 1). As proporções de verdadeiro-positivos e falso-positivos resultados para emparelhado testes foram comparados com o teste qui-quadrado utilizando o EpiCalc 2000 software estatístico (www.brixtonhealth.com/epicalc.html).

Apesar de ser mais verdadeiro-as amostras positivas foram detectadas pelo Merifluor Pneumocystis mancha, este número não foi significativamente diferente daqueles detectados pelo Calcofluor white (P = 0.260) e GMS (P = 0.343) manchas., Da mesma forma, o número de verdadeiros positivos detectados pelo GMS e manchas brancas Calcoflluoradas não eram significativamente diferentes (P = 0,838) um do outro. O número de verdadeiros positivos detectados pelo Diff-Quik mancha, no entanto, foi significativamente menos do que os detectados pela Merifluor pneumonia por Pneumocystis (P = 0,002), GMS (P = 0,027), e Calcofluor white (P = 0,042) manchas. O número de falsos positivos não foi significativamente diferente entre a cor branca, GMS e manchas Diff-Quik (cada comparação tinha um valor P de >0,05)., O número de falsos positivos relatados após coloração com Merifluor Pneumocystis mancha, no entanto, foi significativamente maior do que aqueles relatados após coloração com GMS (P = 0,004), Calcofluor white (P = 0,001), ou Diff-Quik (P = 0,001).em alguns casos, um espécime de sputum induzido pode ser o primeiro espécime recebido para a avaliação da presença de Pneumocystis no trabalho de diagnóstico de um paciente com pneumonia suspeita de ser causada por este organismo (6)., Se um espécime de sputum induzido não conseguir produzir o agente etiológico da pneumonia, então um espécime de lavagem broncoalveolar, que é significativamente mais caro e acarreta um pequeno risco para o paciente, pode ser necessário para obter o material de diagnóstico., Devido a diferenças no tratamento da pneumonia causada por Pneumocystis versus a pneumonia causada por outros microorganismos e a possível necessidade de broncoscopia, o que incorre em um custo adicional e risco para o paciente, no caso de que um diagnóstico não é estabelecido, é importante que o melhor método de coloração ser utilizado para a detecção deste organismo.,além disso, a importância de um método de coloração sensível e específico na era de HAART é particularmente importante, uma vez que a menor prevalência de pneumonia causada por Pneumocystis afeta negativamente o valor preditivo positivo de qualquer doseamento que tenha uma especificidade inferior a 100% (9). Embora a prevalência de pneumonia causada por Pneumocystis seja diferente na era HAART do que na era pré-HAART, a escolha do método de coloração ideal para a detecção de Pneumocystis também é importante para pacientes com outras condições imunocomprometitivas que estão em risco de infecção., De fato, a escolha do método de coloração ideal pode ser mais importante para a detecção de Pneumocystis em pacientes não infectados pelo HIV, imunocomprometidos, uma vez que tem sido demonstrado que as amostras respiratórias destes pacientes têm uma carga menor de organismos do que aqueles de pacientes infectados pelo HIV, imunocomprometidos (6).

na nossa experiência, a mancha de Diff-Quik não foi um meio eficaz de rastreio da presença de P. jiroveci (ou seja, um método primário de coloração) devido à baixa sensibilidade e ao valor preditivo negativo desta mancha. Significativamente mais amostras que continham P., jiroveci foi esquecida pelo método Diff-Quik do que com calcofluor branco, Merifluor Pneumocystis, e GMS. Raab et al. descreva também uma baixa sensibilidade (68%) e uma baixa especificidade (88%) quando apenas a mancha de Diff-Quik foi utilizada para a detecção de Pneumocystis e outros fungos em amostras de lavagem broncoalveolar (10). Estes achados, no entanto, estão em contraste com os de outros grupos, que relataram que o método Diff-Quik foi comparável ao método de coloração GMS para a detecção de Pneumocystis (7, 8)., Um grupo relatou que o método de Diff-Quik era mais sensível do que a coloração branca de Calcofluor, imunofluorescente direta e até mesmo a PCR, mas estes resultados não foram corroborados (1).por outro lado, a coloração de Merifluor Pneumocystis foi o método de coloração mais sensível e pode ser útil como uma tela para descartar a presença de Pneumocystis, mas foi o método menos específico neste estudo. No entanto, o número de resultados falsos-positivos com a mancha de Merifluor Pneumocystis foi significativamente maior do que o relatado para cada uma das outras manchas., A coloração de Merifluor Pneumocystis tinha um valor preditivo positivo de apenas 81,9%, em comparação com os outros três métodos, todos os quais tinham valores preditivos positivos superiores a 96%. Et al. descreveram também resultados falsos-positivos aparentes com este método de coloração (8). Portanto, sugerimos que se a Merifluor Pneumocystis for usada como método de coloração primária num laboratório de Microbiologia Clínica, então a confirmação com um segundo método deve ser realizada para aumentar a especificidade e o valor preditivo positivo do resultado final do teste.,

as sensibilidades das manchas brancas de Calcofluxo e GMS foram intermediárias entre as das manchas de Diff-Quik e Merifluor Pneumocystis, mas foram altamente específicas e apresentaram valores preditivos positivos acima de 96% e valores preditivos negativos acima de 93%. Fraire et al. também descreveram as manchas brancas e GMS como comparáveis para a detecção de Pneumocystis, com 92,6% de concordância (4). Baughman et al., (1a) também descrevem a sensibilidade de um imunofluorescência indirecta mancha que é direcionado para a pneumonia por Pneumocystis e superior na sensibilidade, em comparação com uma modificado de Wright mancha e uma GMS mancha, mas eles informaram sobre um único resultado falso-positivo e, portanto, uma maior especificidade do que descrevemos. É possível que, com prática adicional, se possa reconhecer mais facilmente as formas patognomônicas com a mancha de Diff-Quik, aumentando assim a sensibilidade desse ensaio., Da mesma forma, talvez com a experiência adicional com a mancha de Merifluor Pneumocystis, poderia-se aprender a discriminar melhor entre coloração verdadeiro-positivo e falso-positivo e, assim, diminuir o número de resultados falsos-positivos.na nossa experiência, as manchas brancas e GMS têm os melhores parâmetros para uso de rotina num laboratório clínico. Embora estes ensaios fossem menos sensíveis do que o doseamento da imunofluorescência, eram altamente específicos e apresentavam valores preditivos positivos e negativos mais do que aceitáveis.,

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