“sequenciação de RNA é um método de sequenciação de próxima geração de alto rendimento usado para analisar a expressão genética e estudos de transcriptomia.”
ribonucleico acid is a type of nucleic acid majorly involved in the gene expression, gene regulation and coding/decoding of information.
ARNm – messenger RNA é uma sequência de codificação de um gene implicado na síntese de proteínas, aproximadamente, 4% do grupo de ARN consiste de ARNm enquanto o resto são RNAs não codificantes.,
embora aproximadamente 90% do RNA não sejam codificadores, estes são importantes para o desempenho de várias funções.
Por exemplo,
- tRNA – transfere o aminoácido para o local ribossómico, enquanto a tradução. ARN-ribossómico ajuda na tradução. expressão do gene da microRNA e regulação da expressão do gene. siRNA protege uma célula dos RNAs exógenos. um ARNm é um ácido nucleico de cadeia simples transcrito de um gene e do qual a proteína é traduzida.,
o ARNm ou a transcrição contém apenas as sequências de codificação de um gene. Assim, só possui as sequências que são necessárias na formação de proteínas.
A partir de agora, através da análise de um ARNm, o padrão de expressão do gene relacionado pode ser determinado.
também, o exame de RNA total nos dá uma idéia sobre quais genes estão ligados à formação de proteínas e quais não estão.
significa que a quantidade total de ARN, ARNm e NCR pode ser determinada através do estudo do ARN total.,
Transcriptómica é o estudo de todo o ARNm-frequentemente denominado como transcriptomas ou RNA total presente numa população celular ou celular.
analisando o transcriptoma de uma célula, todo o conjunto da expressão genética pode ser examinado. Uma das técnicas importantes utilizadas nos estudos transcriptómicos é a sequenciação de ARN.
A transcriptoma de um organismo é maior, complexa e mais incerta, ao contrário do genoma.
a transcriptoma varia em condições diferentes e em um ambiente diferente., O estilo de vida, a dieta, o exercício físico, o ambiente, as condições e outros factores externos desempenham um papel significativo na regulação dos transcriptomas.
aqui na sequenciação do ARN, o cDNA sintetizado a partir do ARNm é sequenciado e quantificado num sequenciador. No presente artigo, discutiremos apenas a sequenciação de RNA, mas antes disso Lemos nosso artigo anterior sobre transcriptômica: o que é Transcriptômica?,
tópicos chave:
princípio da sequenciação de ARN:
sequenciação de ARN é um método de sequenciação e quantificação de RNA de alta capacidade de próxima geração utilizado para estudar a transcriptomia e expressão genética.
um cDNA é construído a partir do mRNA total através do processo de transcrição reversa e fragmentada. A ligação do adaptador e a preparação da biblioteca são praticadas antes de se fazer a sequenciação.
o sequenciador lê e quantifica o cDNA complementar ao mRNA.,
Steps in RNA-seq:
- RNA isolation
- cDNA synthesis
- Adaptor ligation
- Library preparation
- DNA fragmentation
- Sequencing
- Downstream applications
RNA isolation:
The first step in the RNA sequencing is the isolation of total RNA, mRNA or ncRNA for the experiment.,
O isolamento do ARN é um processo tedioso em comparação com o isolamento do ADN. O RNA pode ser facilmente decomposto. Além disso, a chance de contaminação é alta no isolamento RNA. deste modo, deve ter-se um cuidado extra enquanto se isola o ARN e a mão experiente na necessidade de o fazer.
RNA puro de alto rendimento é necessário para a sequenciação de ARN.
A pureza e a quantidade do ARN são medidas usando o Nanodrop ou qubit.
Note: for isolating mRNA from the total RNA pool, one additional step is required, using the oligo dT specific column in the purification or final step of elution, total mRNA can be isolated from the rest of RNAs.Agora a nossa amostra de ARN está pronta para o próximo passo.,
transcriptase reversa PCR:
outro conjunto inovador para sequenciação de ARN é fazer transcriptase reversa PCR em que o ARN é transcrito reverso para o ADN.
usando um tipo especial de polimerase conhecido como transcriptase reversa do ADN, o cDNA é sintetizado a partir do ARNm.
Saiba mais sobre RT PCR aqui: transcriptase reversa PCR.
síntese de cDNA da segunda cadeia:
após o cDNA sintetizado a partir do mRNA, é necessária a segunda síntese de ADN da cadeia. Para isso, a PCR é realizada usando a DNA polimerase normal Taq em PCR convencional.,
a polimerase adiciona dNTPs à cadeia de ADN em crescimento usando o conjunto primário.
preparação da Biblioteca:
o primeiro passo na preparação da biblioteca ou preparação da biblioteca do NGS começa com as fragmentações.
Usando o tipo especial de endonucleases de restrição, todo o conjunto de cDNA ds é fragmentado para os NGS.
Nota:
a preparação da biblioteca varia de plataforma para plataforma como alguns fragmentos mRNA antes de realizar a transcriptase reversa, enquanto alguns executam-na mais tarde após a preparação do cDNA.,
na última etapa da preparação da Biblioteca, as extremidades são ligadas com as sequências do adaptador e amplificadas para reparar as extremidades. o dA-tailing é opcional no caso da biblioteca mRNA. purificação da Biblioteca:
toda a Biblioteca é purificada usando o kit de purificação de ADN pronto a usar.
na última etapa, é muito crucial purificar toda a biblioteca de fragmentos para que a concentração da biblioteca seja avaliada usando a PCR quantitativa ou bioanalyzer.,
Nota:
para um iniciante eu acho, a preparação da biblioteca e a fragmentação do DNA é muito difícil de entender, então nós pensamos, devemos escrever um artigo inteiro sobre a fragmentação do DNA genômico, a preparação da biblioteca e sua importância em NGS.
de qualquer forma vamos avançar,
na próxima etapa, a amostra de DNA fragmentado é enviada para sequenciação.
sequenciação do ADN:
Agora a amostra é sequenciada na máquina NGS de alta capacidade que lê a sequência, bem como quantifica o ácido nucleico também.,
a química por trás da sequenciação do cDNA depende de que plataformas estamos usando, embora, o método amplamente utilizado é o uso da química de fluorescência.
no sequenciador, fragmentos individuais são” lidos ” separadamente e sequenciados. Os dados finais são enviados para o laboratório de bioinformática para análise pós-sequenciação.,
Different types of RNA and its function:
Abbreviation RNA types Function mRNA Messenger RNA Codes for protein tRNA Transfer RNA Transfer amino acid to the site of translation., rRNA Ribosomal RNA Catalyse the translation reaction miRNA microRNA Gene regulation siRNA Smaller interfering RNA Gene regulation and maintaining gene expression. LncRNA Long non-coding RNA Transcriptional regulation and epigenetic regulations., snRNA Small nuclear RNA Helps in mRNA splicing and related functions snoRNA Small nucleolar RNA Helps in RNA nucleotide modification piRNA Piwi-intercalating RNA Function in defence against transposon; transposon defence system. scaRNA Small Cajal body-specific RNA Also helps in nucleotide modifications (a type of snoRNA)., shRNA RNA de pequeno gancho de cabelo molécula de RNA sintético ajuda na regulação dos genes e no controlo da expressão dos genes. Transcriptoma de análise de dados:
Um tedioso emprego, como já tratamos no artigo anterior é o transcriptoma de análise de dados e interpretação de resultados. Os dados da NGS são enormes e mais complexos., francamente falando, o ensino da análise de dados da transcriptomia não é possível, deve – se ter prática prática prática para aprender, ainda assim, vou tentar ensinar-lhe o que vem a seguir neste processo. diferentes fragmentos são sequenciados na máquina e os dados são coletados. Na etapa seguinte, com base na região flanqueada dos fragmentos, os chamados “contings” são dispostos para obter variantes de splice.
na próxima etapa, a transcriptoma é comparada com a sequência de referência ou pode ser montada de novo.,
a brief overview of the entire process of RNA-seq.
sequenciação transcriptoma inteiro:
a transcriptoma total de uma célula ou tecido – todas as RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, sncRNA, microRNA e siRNA) são sequenciadas e quantificadas. Em outras palavras, podemos dizer que ambos os romances, bem como transcrições conhecidas, podem ser sequenciados.para isso, todo o conjunto de RNA é extraído da amostra de tecido., sequenciação de ARN-alvo:
um grupo específico de genes, específico de um gene, um grupo de transcriptomas específicos de uma via ou relacionados com a doença são sequenciados na sequenciação de ARN-alvo específica. a sequenciação de ARN alvo é mais acessível e precisa do que a sequenciação transcriptoma total. Além disso, é necessária uma menor quantidade de amostra de ARN para a realização da experiência.
pequena sequência de ARN:
uma das técnicas mais emergentes na sequenciação de ARN é estudar o menor ARN não codificador de uma célula, porque estes estão associados com tantas funções em um genoma., moléculas de RNA menores como miRNA, siRNA e piRNA podem ser quantificadas e sequenciadas através do método de sequenciação de RNA baseado em NGS para várias aplicações.
sequenciação de mRNA:
sequência completa da transcrição de mRNA usando a seleção de cauda poli(a) utilizada para estudos de expressão genética. Usando o sequenciamento mRNA conhecido, bem como nova alteração transcript pode ser detectada.
vantagens da sequenciação de ARN:
uma das principais vantagens da sequenciação de ARN é a não necessidade de informação prévia da sequência., Como todo o processo não é baseado na química baseada em sonda, informação de sequência prévia para projetar a sonda não é necessária aqui.
estudo de expressão genética mais preciso e sensível pode ser feito. gama dinâmica mais ampla.
Capture both known as well as novel alterations of the transcript, even if no sequence information is available.
apesar de não estar disponível informação da sequência de referência, a sequenciação de ARN pode ser aplicada a qualquer espécie. relacionado: genoma sintético-métodos, aplicações e desafios.,
Conclusion:
Conclusively we can say, that the RNA seq method is more advanced and accurate as compared to the microarray. Também podem ser descobertas mutações de novo usando-as.