PCR is the technique of modern molecular biology labs. Se você precisa copiar, sequência ou quantificar o DNA , você precisa saber PCR. Em resumo, PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica bioquímica que usa termociclagem e enzimas para copiar o DNA de forma rápida e confiável, e foi inventado em um flash de inspiração por um cientista dirigindo na rodovia 128 de San Francisco para Mendocino.,
Este artigo dá uma breve e básica visão geral da PCR, com algumas dicas para ajudá-lo a evitar as armadilhas mais comuns. Se você é novo, ou relativamente novo para PCR, então isso é para você. (E mesmo se você tiver experiência no PCR, vale a pena ler para refrescar, e talvez pegar uma dica ou duas!).ingredientes básicos de PCR: polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase polimerase são enzimas que, nas condições certas, podem reunir novas cadeias de ADN a partir de ADN-modelo e nucleótidos. A reação original da PCR foi complicada porque as altas temperaturas necessárias para desnaturar o DNA matariam as polimerases., Isto significava que depois de cada ciclo de aquecimento, novas polimerases precisavam ser adicionadas manualmente à reação– um esforço caro. No entanto, na PCR moderna este não é um problema, como as polimerases usadas na PCR moderna geralmente vêm de uma das duas fontes de bactérias termófilas, Thermo aquaticus ou Pyrococcus furiosus. Estas polimerases, respectivamente, Taq (pronunciado “tack”) e Pfu (pronunciado” P-F-U”) resistem facilmente às altas temperaturas associadas a uma reação PCR., As Taq comerciais e as Pfu polimerases são projetadas para velocidade, fidelidade, processividade (capacidade de completar leituras longas), e sua capacidade de ler modelos ricos em GC. As empresas estão constantemente a sair com novas polimerases. Portanto, não se conformar com “o que está em seu congelador”, mas loja em torno para a melhor polimerase comercial para as suas necessidades PCR. Fale também com o seu representante de vendas local, como eles podem muitas vezes dar amostras de polimerase livre, para que você possa decidir o que é melhor para você.
ADN-modelo
Este é o ADN para o qual projecta os seus iniciadores., É o ADN que a tua polimerase vai ler e copiar. Seu DNA modelo pode ser genômico, plasmídeo ou cDNA, mas qualquer que seja a sua qualidade fonte conta. Quanto mais intacto e mais puro o seu DNA modelo, mais fácil é obter bons resultados PCR. Tenha também em mente que a quantidade ideal de ADN dependerá da sua fonte, normalmente 1 PG – 1 ng de ADN plasmídeo ou 1 ng – 1 µg de ADN genómico por reacção PCR.os primários
os primários
são fragmentos curtos de ADN sintetizado que se ligam ao seu ADN-modelo. Você vai precisar projetar um” forward ” primer e um “reverse” primer., O seu primer dianteiro designa o início da sua PCR. Esta sequência de iniciação é a mesma que a sua sequência de ADN-padrão 5-3. O seu primer reverso designa o fim da sua PCR. A sequência deste primer é o complemento reverso do seu ADN-padrão. Em geral, os iniciadores têm 18-22 pares de base de comprimento. No entanto, mais importante do que o seu comprimento é a temperatura de fusão dos seus iniciadores. A temperatura de fusão dos seus iniciadores deve ser de 54-60°C e tão semelhante quanto possível um ao outro., Existem muitas calculadoras on-line que podem calcular as temperaturas de recozimento de primer, e a maioria das empresas que sintetizam primers fornecem tais Calculadoras.os nucleótidos
como monómeros de ADN, os nucleótidos são necessários para fazer cópias de ADN. Para a maioria das PCRs de ADN, irá utilizar trifosfatos de Desoxinucleósidos (dNTPs). Você pode comprá-los separadamente ou como um dGTP, dCTP, dATP e dTTP mix. O que quer que você comprar, no entanto, tenha em mente que os nucleótidos são muito sensíveis para congelar/descongelar ciclos. Portanto, é melhor sempre criar alíquotas pequenas de seu dNTPs., Certifique – se também de que os armazena correctamente-não utilize um congelador isento de gelo que passe por ciclos automáticos de descongelação.
tampão
a maioria das polimerases comerciais vêm com o seu tampão ideal. Estes tampões não só fornecem o pH correto, mas eles sempre têm aditivos como magnésio, potássio, ou DMSO, que ajudam a otimizar a desnaturação do DNA, a renaturação e a atividade de polimerase. Haverá mais sobre estes aditivos em um próximo artigo.
Termociclagem:
é aqui que a magia acontece., Todos os ingredientes acima são adicionados a um tubo PCR e o tubo é termociclado. A fim de alcançar a termociclagem quando a PCR foi inventada pela primeira vez tubos PCR individuais foram movidos manualmente entre banhos aquecidos de água. (E você acha que seu trabalho no banco é entediante! Agora, graças à invenção de “Mr.Cycles”, a primeira máquina de termociclagem, a regulação da temperatura é agora feita automaticamente por termocicladores. O seguinte é um perfil termociclador típico da PCR:
inicialização
nesta etapa a reação é aquecida a 94-96 ° C por 30 segundos a vários minutos., Este passo é geralmente feito apenas uma vez no início de sua reação PCR. Este passo é importante para ativar polimerases de arranque a quente, se você estiver usando tal polimerase, e para desnaturar seu DNA modelo. Tenha em mente que se o seu conteúdo de Modelo GC é alto você pode precisar para realizar um passo de inicialização extra-longo.
desnaturação (repetida 15-40 vezes)
nesta etapa, a reacção é aquecida a 94-98°C durante 15-30 segundos. Este passo denuncia o seu ADN e os seus primários, o que lhes permitirá receitar-se uns aos outros no próximo passo.,
recozimento (repetido 15-40 vezes)
nesta etapa, a temperatura da sua reacção é rapidamente reduzida para 50-64°C durante 20-40 segundos. A temperatura neste passo precisa de ser baixa o suficiente para que os seus primários desnaturados possam formar pares de base Watson-Crick com o seu ADN-padrão. Mas suficientemente alto para que apenas as estruturas de ADN de cadeia dupla mais estáveis (perfeitamente emparelhadas) possam formar-se. Normalmente, esta temperatura perfeita de recozimento é alguns graus mais baixa do que a temperatura de fusão do seu par primário. Também durante esta etapa a sua polimerase irá ligar-se ao seu complexo de ADN primer/template., Embora a sua polimerase não começará a ler até que a temperatura seja elevada na próxima etapa.
Elongação ou extensão (repetidos 15-40 vezes)
neste passo a sua reacção é rapidamente aquecida até 72-80°C. É quando a sua polimerase começará a ler (na direcção 5-3) e a copiar o seu ADN-modelo (na direcção 3-5). A temperatura mais elevada durante esta etapa reduz as interações não específicas primer/template DNA, aumentando assim a especificidade de sua reação., No entanto, a temperatura exacta será determinada pela preferência da sua polimerase, por isso leia a sua embalagem. O comprimento deste passo depende de quanto tempo sua cópia de DNA será. Normalmente, a DNA polimerase pode copiar 1.000 pares base por minuto. Portanto, você precisa permitir pelo menos 1 minuto de tempo de extensão por 1.000 bases. No final desta incubação, terão sido criadas novas peças de ADN de cadeia dupla, que consistem tanto no modelo como no novo ADN.
passo 2-4 são então repetidos 15-40 vezes
é verdade que quanto mais ciclos você programar, mais cópias de DNA você criará., No entanto, existe um limite superior. Em algum momento os nucleótidos livres disponíveis tornam-se limitantes e cópias de DNA truncadas prematuramente podem se tornar um problema. Por isso, não sejas ganancioso com o teu ciclismo. Menos, mas bom produto de PCR limpo é preferível a lotes de produto Sujo.
alongamento Final
Este é um passo opcional mas frequentemente recomendado. Nesta etapa a reação é realizada a 70-74 ° C por vários minutos. (Usualmente você usará a mesma temperatura que usou na etapa de alongamento ou extensão.) Este passo permite que as polimerases terminem de ler qualquer cadeia que eles estão atualmente., Este passo opcional pode ajudar a reduzir o número de cópias truncadas em seu produto final.a sua reacção está agora completa. Uma vez que todo o processo pode demorar algumas horas, As reacções PCR são muitas vezes feitas de um dia para o outro ou quando se afastou; recomenda-se que programe o seu termociclador para manter o seu produto PCR a 4°C até ao seu regresso. Nesse momento você pode analisar ou usar o seu produto, ou transferi-lo para um armazenamento de longo prazo mais adequado, como o seu frigorífico.boa sorte e boa sorte!
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